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39450字硕士毕业论文肝细胞核因子4受体激动剂的计算机辅助筛选

论文类型:硕士毕业论文
论文字数:39450字
论点:受体,细胞核,蛋白
论文概述:

本文利用计算机模拟的技术对人与小鼠体内HNF4孤儿核受体家族的两个重要亚型HNF4α、HNF4γ进行研究,所涉及的研究方法主要有同源模建、虚拟筛选和分子对接。首先根据已知的鼠源HNF4α、人源

论文正文:

第一章前言

肝细胞核因子4受体是核受体超家族中的核受体亚家族成员之一。它共有α、β和γ三种亚型。然而,β亚型只在非洲爪蟾中发现。α和γ亚型在哺乳动物中具有很高的同源性和丰富的表达。HNF4α是HNF4的一个重要亚型,参与体内许多基因的转录和表达,包括碳水化合物和脂质代谢、肝细胞分化、肝功能维持、肝脏解毒、胆汁酸合成、血清蛋白产生等相关基因。HNF4α基因的表达和功能障碍与糖尿病、肝纤维化、脂肪肝、肝癌等疾病的发生密切相关。例如,人HNF4α基因P2启动子的突变可在体内引起显著的胰岛素抵抗,导致年轻人成人糖尿病(MODY1)的发作,而HNF4α应答元件的突变可导致血友病和MODY3。HNF4γ参与肠上皮细胞表型变化的调节和慢性炎症过程。HNF4 γ的异常表达或功能可能诱发溃疡性结肠炎和其他疾病。研究发现HNF4α在正常分化和成熟肝细胞中高表达,而在各种慢性肝病如肝纤维化和肝癌中其表达水平下调。外源性导入HNF4α基因可逆转肝纤维化,上调肝细胞相关功能基因的表达,显著诱导肝癌细胞凋亡。由此可见,HNF4α基因的激活可以预防肝纤维化、肝癌等慢性疾病的恶化,促进肝脏相关功能基因的正常表达,治疗各种慢性肝病。因此,HNF4α激动剂的发现和研究将为开发治疗上述疾病的新药提供可靠的理论依据。HNF4自发现以来一直被认为是一种组成型活化核受体。它的转录调节功能不依赖于配体的结合。因此,HNF4被列为核受体亚家族。然而,结构分析表明该蛋白含有亲脂性配体结合区,HNF4α和γ蛋白晶体结构均含有长链脂肪酸配体。因此,HNF4目前被认为是一种新的药物靶标,它可以通过改变其转录活性来调节某些特定基因的转录和表达,从而治疗由其功能障碍引起的各种临床疾病。本文首次通过同源构建小鼠源性HNF4γ蛋白的三维结构模型,并通过PDB检索下载获得人HNF4γ、人HNF4α蛋白和小鼠源性HNF4 α蛋白的晶体结构。采用计算机辅助药物筛选方法,从锌数据库下的ZDD、ZMD和ZIM子数据库中筛选出两种有效的小分子化合物ZINC04026555和ZINC00577115。分子对接实验证明,这两种激动剂对相应蛋白质的结合能力远远高于晶体结构中长链脂肪酸的结合能力。因此,我们所筛选的两种小分子化合物被认为可以作为HNF4α和HNF4γ的有效激动剂来激活这两种基因的转录激活功能。这将为靶向HNF4α和HNF4γ蛋白的新药研发提供启示。

1.1核受体超家族简介
核受体超家族是存在于后生动物(如脊椎动物、节肢动物、线虫等)中的一组非常丰富的细胞内转录因子。),它们参与调节细胞增殖和分化、能量代谢、生长和发育、生殖以及生物体中的其他生命活动。在高等真核生物中,转录机制整合了一整套内部和外部细胞信号,这些信号通过不同的方式传递到细胞核,以调节每种生命活动的进程。各种细胞信号经常相互干扰,导致每个基因的充分表达。核受体构成已知最大的真核转录调节因子超家族[1]。核受体(NRs)通过配体激活来调节特定基因的表达,从而建立转录反应机制。核受体功能异常或受其调节的基因表达障碍可导致一系列疾病,如糖尿病、代谢综合征、多种癌症等。由于核受体以配体依赖的方式调节特定基因的转录和表达,它们作为一个重要的药物设计靶点已经受到越来越多的关注。近年来,对核受体家族成员的研究越来越热门,研究成果相当可观。核受体的激动剂或拮抗剂已广泛用于避孕、抗炎反应、预防骨质疏松症以及治疗皮肤病、癌症和其他疾病。目前,临床上用于改善2型糖尿病胰岛素敏感性的噻唑烷二酮(TZD)药物是核受体成员PPARγ的激动剂。核受体自发现以来只有20年的历史,但发展迅速。1985年,霍伦伯格等人敲除了第一个核受体——糖皮质激素受体的基因,开启了核受体[2]的发现和研究。随着核受体的研究和发展,1999年,国际药理学委员会和受体命名和药物分类协会成立了核受体命名委员会,提出了核受体的系统命名法
2.1简介
HNF4基因高度保守,是一种组成型活化核受体,具有核受体的五个典型区域,即甲/乙区(包括AF-1)、脱氧核糖核酸结合区、配体结合区(包括AF-2区)、丙区铰链区和氟区。经检索发现,人和小鼠HNF4α蛋白和人HNF4γ蛋白的晶体结构已知,而小鼠HNF4γ蛋白的结构未知。人HNF4γ和小鼠HNF4γ蛋白的同源性很高。同源建模方法可以准确预测mHNF4γ蛋白的三维结构模型。同源建模是一种基于模板的建模方法,可以根据已知蛋白质的氨基酸序列预测目标蛋白质的三维结构。常用的同源性建模软件包括发现工作室(Discovery Studio)、瑞士模型(SWISS-model)、预测蛋白质(PredictProtein)、Jpred等。本章使用探索工作室(Discovery Studio)软件对mHNF4γ蛋白的三维结构模型进行建模,为后续小分子化合物激动剂的虚拟筛选提供受体蛋白模型。。根据序列同源性,核受体可分为6类,表达为1,2,3,4,5,6,其余为0。每个亚科分为甲、乙、丙...几组[4】。研究表明,核受体的配体是亲脂性小分子,如类固醇激素、类花生酸、羟基类固醇、胆酸、脂肪酸、甲状腺激素、维生素D、简并素、9-顺式和所有反式维甲酸、氧化甾醇、前列腺素J2、白三烯B4、法呢醇代谢物等。可用作配体分子结合相应的核受体。此外,根据配体是已知的还是能与相应的配体结合,核受体可分为三种类型:一种是配体未知的核受体,称为孤儿核受体或孤儿核受体(ONRs)) [3],如HNF4、ROR、SHP等。;一种是核受体(采用的受体),其天然配体是已知的,如磁共振、血管成像等。一种是典型的内分泌核受体(经典内分泌核受体)。寻找孤核受体的配体对于理解该受体的转录调控,为进一步发现新药靶点提供重要依据具有重要意义。

第2章小鼠HNF4γ的结构预测和构象评价

[5]

2.2实验方法
目前有许多软件和方法可以根据蛋白质的一级序列预测蛋白质的三维空结构。本文利用发现工作室(Discovery Studio)软件建立同源模型,构建小鼠HNF4γ蛋白的三维结构模型。建模师,拉马钱德兰绘图,剖面图-3D和其他程序被特别使用。

第三章HNF4激动剂的虚拟筛选......26
3.1导言.........26
3.2.1实验方法.......27
3.2.1.1获取和制备小分子化合物.......27
3.2.1.2 HNF4蛋白活性位点预测...27
3.2.2.3准备受体分子文件并设置网格参数...27
3.2.2.4启动AutoDock Vina执行激动剂...28
3.2.3结果讨论.......28
3.2.3.1 HNF4活动点预测.......28
3.2.3.3 HNF4虚拟筛查结果.......29
3.3 HNF4激动剂分子对接.......30
3.3.1实验方法.......30
3.3.2结果讨论.......31
3.3.2.1 HNF4与对照药物的分子对接...31
3.3.2.2 HNF4与选定的小分子对接...32
3.4本章概述...38
第4章的结论...40

结论

本文以人和小鼠源孤儿核受体家族成员HNF4α和HNF4γ为靶点,通过计算机辅助同源性建模、虚拟筛选、分子对接等方法研究其有效激动剂。根据BLAST搜索,人类HNF4α和HNF4γ以及小鼠HNF4α蛋白的晶体结构是已知的,三者的晶体结构都含有天然小分子,这为我们的虚拟筛选和分子对接实验提供了阳性对照药物。小鼠HNF4γ蛋白没有晶体结构,其三维结构只能通过同源建模来预测和模拟。通过BLAST同源序列搜索,发现人HNF4γ与其蛋白序列具有最高同源性。利用发现工作室软件中的MODELER程序构建了HNF4γ的三维结构模型。构建的结构模型与其模板蛋白的晶体结构相似,包括13个螺旋、2个折叠和15个角。三维蛋白质结构模型通过Ramachandran图和Profiles-3D程序进行评估,通过两个不同程序对模型的评分,确定蛋白质模型的结构稳定合理。
本文以锌数据库中的ZDD、ZMD和ZIM子数据库为虚拟筛选小分子化合物库。这些小分子化合物的总数是30000个,但是分析表明有许多重复。经过合并和处理,建立了一个包含17,000个用于本实验的小分子化合物的虚拟筛选库。利用AutoDock Vina软件从构建的小分子复合文库中筛选人和小鼠来源的HNF4α和HNF4γ蛋白激动剂。由于人和小鼠HNF4α和人和小鼠HNF4γ的高度保守性,特别是配体结合区,两种物种的最佳化合物是相同的。用分子对接法检测筛选出的两种小分子化合物与靶蛋白的相互作用效果。Autodock软件充分考虑了受体-配体复合体的整体结构,计算了受体蛋白和小分子化合物的电荷、原子类型和二面角。Autodock软件输出的复合物的亲和能值发现,两种小分子化合物与靶蛋白之间的结合力强于其晶体结构中所含的天然配体。本文利用计算机技术从17000种小分子化合物中筛选出了HNF4α和HNF4γ蛋白的小分子激动剂。分子对接实验证实,这两种小分子化合物确实可以结合到相应的HNF4α和HNF4γ蛋白的配体结合区,从而激活它们。

参考
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[7]罗宾逊-里查维,埃斯克里瓦·加西亚·赫,劳德诉核接收器超级家庭[]。《细胞科学》,2003,116 (Pt 4) : 585 -586。
[8]布克奥特·艾尔,郑伊,道恩斯·M,等.核受体表达的解剖学特征揭示了一个分级转录网络[.cell,2006,126 (4) :789 - 799。
[9]李德·K,索德斯特罗姆.核受体辅压因子中LXXLL基序的功能分析[中国核科技信息与经济研究院]。类固醇生物化学分子生物学,2004,91 (4 - 5) :191 - 196。
[10]李平,范文,许军,等.脂肪细胞NCoR敲除降低PPARγ磷酸化,增强PPARγ活性和胰岛素敏感性[.手机,2011,147(4):815–826。