40000字硕士毕业论文禽脑脊髓炎病毒YBF02株毒力测定及种子批建立

论文类型：硕士毕业论文

论文字数：40000字

论点：雏鸡,接种,感染

论文概述：

目前国内还没有弱毒疫苗研制成功的报道。本研究用青岛易邦生物工程有限公司提供的禽脑脊髓炎病毒（AEV-YBF02 株）进行毒力测定和活疫苗种子批的建立。

论文正文：

第一章禽脑脊髓炎的研究进展

禽脑脊髓炎(禽脑脊髓炎；AE)，又称表皮震颤(Epimic震颤)，是由禽脑脊髓炎病毒(AEV)引起的病毒感染性疾病，主要危害4周龄以下的鸡。其主要特征是由侵入鸡的中枢神经系统引起的鸡非化脓性脑炎，主要表现为运动障碍、头颈震颤和后脚趾麻痹等神经症状(Calnek etal .1999)。4周龄以下的鸡感染AEV病毒后，发病率一般为20% ~ 60%，死亡率平均为25%，也可超过50%(张淑侠等人，2000年)。成年母鸡的感染没有表现出神经症状，但它可以导致产蛋量暂时下降，从16%到43%(秦卓明，1997年)，有些高达60%以上(甘侯猛，1999年)，大约两周后产蛋量可以恢复正常。然而，这一时期产生的卵毒性很高，在孵化期间表现出两种趋势:一些鸡胚在孵化后期死亡；虽然另一部分可以从壳中孵化出来，但当它从壳中出来时或出来后的几天内，就会出现临床症状。这些小鸡的粪便中含有大量病毒，这些病毒会感染其他小鸡。易感鸡一年四季都可能被感染，冬季和春季感染更多。美国琼斯等人(1932年)于1930年首次在2周大的商品鸡身上发现不良事件，表现为快速震颤。1932年，这种疾病传播到新英格兰，因此不良事件也被称为“新英格兰病”。1934年琼斯(1934)等人利用自然感染鸡的脑组织滤液在大脑中接种易感鸡，并首次复制了这种疾病。Van Roekel等人根据1938年的实验分类将其命名为“禽脑脊髓炎”。1958年，沙夫(1958)第一次报告说，这种疾病通过免疫接种得到了成功控制。卡尔内克(Calnek)等人在1960年阐明了不良事件的流行病学，并率先开发出口疫苗，这成为当今世界控制商品鸡不良事件的基础。目前，世界上许多国家和地区都报告了这种疾病的发生。中国最早的报告是张吉泽于1980年在广东的鸡群中发现疑似AE。1982年，李新平通过组织病理学被诊断出患有这种疾病。1983年，毕左颖通过流行病学和组织病理学被诊断患有该疾病。姚大明(1989)、秦爱建(1994)、赵振华(2000)和姚永秀(1996)先后进行了AEV的分离鉴定和疫苗的开发应用。近年来，辽宁、江苏(秦爱建等，1994)、黑龙江、河北、山东(刘思当，2000)、内蒙古(赵振华，2000)、福建、上海、河南、江西、陕西等地均有不良事件的报道。这表明这种疾病在我国很普遍。

1.1 AEV[的流行病学/br/]自然感染可在鸡、雉鸡、火鸡、鹌鹑、雉鸡、珍珠鸡、日本鹌鹑和火鸡中发现。各种日龄的鸡都可能被感染，但大多数发生在3周以下的鸡身上。常见家禽感染有明显的临床症状，AEV感染有明显的日龄易感性。鸡和雏鸽可以被人工感染，但是豚鼠、小鼠、兔子和猴子对AEV的脑接种有抵抗力。

1.1.1传播模式
在实验室中，通过在大脑中接种鸡来复制声发射可以获得最一致的效果。实验证实的其他感染途径包括腹膜内、皮内、皮下、肌肉、静脉、坐骨神经、眼内、口服和鼻内接种。吕中华等人(1997)也成功地用脚趾接种感染雏鸡，但潜伏期较长，发病率较低。AEV在自然条件下通常通过水平传播和垂直传播传播疾病。一般来说，它不是由空空气和吸血昆虫传播的。一般来说，2周内鸡的发病率主要与垂直传播有关。2周龄以上鸡的感染主要与水平传播有关。水平传播是由食物摄入引起的肠道感染。由于大多数野生病毒株都是嗜肠病毒，病毒可在鸡肠道内繁殖，并随粪便排出体外，污染寝具、孵卵器和育雏设备，成为病毒传播的来源。沙夫伦和坦诺克(1989)的一项研究发现，在感染aev后4 ~ 10天，可以在鸡的粪便中检测到病毒。排泄物解毒的持续时间在一定程度上与日龄有关。几天大的鸡解毒超过2周，而三周大的鸡只解毒5天。因为这种病毒对环境有很强的抵抗力，可以存活至少4周，所以它具有长期的传染性。在此期间，病鸡粪便中被AEV污染的饲料、饮用水、寝具和器具可通过摄入或接触导致其他鸡感染。因此，一旦病毒侵入鸡舍，它将很快在鸡群中传播。如果养鸡场没有特别的预防措施，就会造成鸡舍之间的传播。不同年龄分开饲养的鸡比不同年龄一起饲养的鸡感染的可能性小。网箱养殖比地面自由养殖传播得慢(刘思当，2000)。Calnek等人(1999年)证明，病毒也可以在易感胚胎和胚胎之间水平传播。6日龄接种的鸡孵化后可出现明显的临床症状。与接种胚胎一起孵化的健康胚胎在孵化后第10天开始显示临床症状，而由从接种胚胎分离的同一批健康胚胎孵化的鸡不显示任何疾病。这样，被污染的孵化器和其他孵化器也成为病毒传播的载体。

第二章病毒毒力的测定

禽脑脊髓炎病毒易于通过口服途径感染鸡，并可通过致病性和组织趋向性在肠道内繁殖。然而，口服嗜肠AEV株不会导致鸡感染。从对鸡胚的适应性来看，亲肠道菌株不适合鸡胚，对鸡胚无致病性，不会引起明显症状和严重的病理变化。亲神经菌株已经适应鸡胚，并对它们具有致病性。接种鸡胚会引起典型的病理变化。因此，生产活疫苗的菌株应该是亲肠道的，能通过口服途径感染鸡群，对鸡胚无致病性。此外，本发明的活疫苗毒株致病性应较小，从而在用于鸡体的人工免疫时可以避免流行病的爆发。

第三章种子批次的建立.........................................32-38
3.1材料.........................................32
3.2方法.........................................32-34
3.3结果.........................................34-36
3.4讨论.........................................36-38
第四章安全性试验和免疫效力试验.........................................38-45
4.1材料.........................................38
4.2方法.........................................38-39
4.2.1安全测试.........................................38-39
4.2.2免疫功效测试.........................................39[/比尔/] 4.3结果.........................................39-44
4.3.1安全测试.........................................39-42
4.3.2免疫功效测试.........................................42-44[/比尔/] 4.4讨论.........................................44-45
第五章毒性试验.........................................45-48[/比尔/] 5.1。材料.........................................45
5.2方法.........................................45-46

结论

第5代AEV YBF 02种子批经口服接种2周龄SPF雏鸡。同居感染传播了5代。将同居感染传代后分离的病毒分别接种到1日龄SPF雏鸡、28日龄SPF雏鸡和180日龄蛋鸡的脑中。结果表明，对1日龄鸡、28日龄SPF鸡和产蛋鸡的毒力没有变化，仍为适应弱毒力的非鸡胚，与原毒力一致。根据荣龚俊等人(2001)的研究，鸡胚病毒连续5代通过易感鸡体，可以观察毒力的变化来判断病毒是否有毒力逆转。因此，AEV-YBF02株病毒是安全稳定的，因此当鸡作为活疫苗免疫时，病毒的毒力不会在鸡体内再生，并造成不良事件爆发的风险。然而，在这个实验中，同居感染已经传播了5代。为了充分了解病毒在易感鸡体内的毒力是否正在恢复，有必要在易感鸡体内传播更多代，以观察毒力的变化。
接种后，AEV YBF02菌株在鸡胚中未引起明显的眼部损伤。当一天大的小鸡被接种到大脑中时，小鸡直到10天后才会发育。这是一种嗜肠AEV减毒株。病毒种类在传代过程中是稳定的，可以被AEV阳性血清特异性中和。病毒种类不含细菌、支原体和外源病毒，病毒种类纯正。该病毒株安全稳定，致病性弱，免疫原性好，传代不影响病毒的免疫原性，可作为活疫苗的种子病毒。