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39420字硕士毕业论文壳聚糖-硬脂酸接枝物/蛋白质/脱氧核糖核酸三元复合基因给药系统的研究

论文类型:硕士毕业论文
论文字数:39420字
论点:嫁接,复合物,壳聚糖
论文概述:

本研究釆用生物酶降解法获得重均分子量为18.0kDa的壳聚糖,在水性和酸性介质中具有良好的水溶性。通过碳二亚胺介导,使壳聚糖主链上的自由氣基与硬脂酸上的羧基反应形成酰胺键,实现对

论文正文:

壳聚糖-硬脂酸接枝物的合成及理化性质

本研究利用壳聚糖酶降解高分子量壳聚糖,制备低分子量壳聚糖。以碳二亚胺(EDC)为交联偶联剂,将疏水性硬脂酸共价结合到壳聚糖的气体基团上,合成壳聚糖-硬脂酸接枝物。核磁共振氢谱证实了接枝物的化学结构。接枝物的氨基取代度用三苯并硫代酸法测定。用灼烧法测定接枝物在水中的临界胶束浓度。用粒径和表面电位分析仪测定了接枝胶束在水溶液中的粒径和表面电位。用透射电镜观察壳聚糖-硬脂酸接枝胶束的形态和大小。

1.1试剂和仪器

1.1.1试剂
壳聚糖(壳聚糖,分子量450kDa,脱乙酰度95%,浙江玉环海洋生物化学有限公司),壳聚糖酶(壳聚糖,Dyadic国际有限公司,美国),葡聚糖标准样品(美国聚合物实验室有限公司),硬脂酸(硬脂酸,南澳,上海化学测试雕刻厂),碳化二亚胺(西格玛化学有限公司,美国),三聚苯基反相酸(西格玛)。美国圣路易斯公司)、弗劳尔斯公司(美国比利牛斯山脉奥尔德里奇化学公司)、盐酸公司(杭州化学试剂有限公司)、碳酸氢钠公司(上海洪光化工厂)、其他溶解和试剂均为分析纯或化学纯。

1.1.2仪器
BS110S电子天平(这里是京赛多利斯天平有限公司),集热恒温加热磁力拉具(巩义市英乐裕华仪器厂);核磁共振仪(交流-80,德国布鲁克生物针公司)、紫外透射成像系统(美国BioRad公司通用引擎盖二)、超声波清洗机(USC-202,上海博龙电子设备厂);粒度和ζ电位分析仪(3000HS,马尔维科。英国),透射电子显微镜(透射电子显微镜,立体扫描,徕卡,英国),土壤二氧化硫细胞培养箱(3110,美国热成型公司);XW-80A旋转混合器(上海医科大学仪器厂)、TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂制造)、紫外-1800、北京通用仪器有限公司、发光分析仪(日本日立公司F-2500)、电动恒温水浴槽(上海景洪实验设备有限公司DK-S24)、电动恒温鼓风干燥箱(DHG-9M5A、上海一恒科技有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1低分子量壳聚糖的制备和分子量测定称取20g
壳聚糖(分子量450 kDa),加入1000毫升1.25%(体积/体积/体积)盐酸溶液中,混合橄榄溶解。水浴加热,在55℃下缓慢加入壳聚糖酶水溶液(约lU/毫升),搅拌使其完全溶胀,在400转/分和55℃下降解壳聚糖。反应完成后,将反应体系加热至80℃。c使壳聚糖酶失活并终止反应。加入0.3%(重量/体积)活性炭,在室温下搅拌30分钟。LOmin以4000转/分的速度离心以除去活性炭。上清液用微孔膜(0.45^im水膜)进一步过滤得到壳聚糖水溶液,喷雾干燥得到壳聚糖粉末。凝胶渗透色谱法测定壳聚糖的分子量[3G]。使用茨克凝胶柱(G3000SW),流动相为0.1 M乙酸钠溶液(pH6.0);柱温:25℃,流速:0.8毫升/分钟,进样体积:用分子量为5.9、11.8、22.8、47.3、112千道尔顿的葡聚糖标准样品制备标准洗脱曲线,用洗脱曲线计算壳聚糖分子量。

1.2.2壳聚糖-硬脂酸接枝物的合成
壳聚糖-硬脂酸接枝物由碳二亚胺(L-ehytl-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)合成。称取1.0 g壳寡糖(17.5 kDa),加入60毫升去离子水,搅拌溶解。取处方量硬脂酸,溶于40毫升乙醇中,加入处方量EDC,60。搅拌30分钟。将上述两种溶液混合,以400转/分的速度磁力搅拌,并控制80。c反应4将最终反应溶液在透析袋(加利福尼亚州拉古纳山光谱实验室mwco 7kda)中透析48小时,以除去水溶性副产物。冷冻干燥透析液,得到接枝固体粉末。将固体粉末分散在无水乙醇中,水浴超声15分钟(40W),用称为0.45的微孔滤膜过滤除去未反应的硬脂酸,重复3次,取过滤后的固体产物,再溶于蒸馏水中,冻干,得到纯化的壳寡糖-硬脂酸接枝物。

2壳聚糖-硬脂酸接枝物/蛋白质/脱氧核糖核酸三元配合物的制备及基因转染行为

用乙酰氯乙酰化牛血清白蛋白合成不同等电点的蛋白质。ζ电位法用于测定蛋白质的等电点。共孵育制备了不同等电点的壳聚糖-水杨酸/脱氧核糖核酸二元复合物和壳聚糖-水杨酸/牛血清白蛋白/脱氧核糖核酸三元复合物。粒度和表面电位测试仪用于测量二元化合物和三元化合物的粒度和表面电位。透射电镜观察纳米颗粒的形貌。凝胶电泳用于分析接枝胶束与脱氧核糖核酸之间的粘附程度。以表达绿色磨光蛋白颗粒的基因为报告基因,以HEK293细胞为模型细胞,在磨光倒置显微镜下观察绿色磨光蛋白的表达,流式细胞仪测定转染效率。比较了二元复合物和三元复合物的转染差异。用激光共聚焦显微镜观察复合柚皮苷的细胞摄取和细胞内释放行为,用流式细胞仪观察定量摄取效果。用MTT法研究药物传递系统的细胞毒性。探讨不同等电点蛋白质对基因转染的影响及其可能的机制。

2.1试生产和仪器

2.1.1试剂
壳聚糖-硬脂酸接枝物(CS-SA)。牛血清白蛋白(牛血清白蛋白,牛血清白蛋白,蓝天),脱氧核糖核酸(鱼精子脱氧核糖核酸(上海生物工程技术服务有限公司),真核表达质粒pEGFP-C1(上海申能蔡波生物技术有限公司),溴化乙锭(ETBR,西格玛,美国),异硫氰酸酯(异硫氰酸荧光素,FITC,西格玛,美国),d-唾液酸三甲基(3-(4,5-二甲基-噻唑啉-2-基)-2,5-二苯基-四唑溴,西格玛,美国),脂转染胺?2000年(美国Invitrogen公司)、细胞培养基DMEM(美国吉布伯尔)、胰蛋白酶(美国BRL吉布科台平)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、绿光燃烧蛋白颗粒pEGFP-C1(浙江第一医院捐赠)、四甲基罗丹明TAMRA标记的脱氧核糖核酸(脱氧核糖核酸为反义核苷酸LY2181308,序列为5’-tgtgtgtgctattgtgaatt-3’,上海生物技术有限公司)、溶酶体标记溶酶体跟踪器(溶血跟踪器?蓝色DND.22,Invitrogene,美国).

3壳聚糖-硬脂酸接枝物/蛋白质/pshSUR三元配合物........37
3.1试剂和仪器.......37
3.1.1试剂.......37
3.1.2仪器.......37
3.2试验方法.......38
3.2.1细胞培养.......38[/比尔/] 3.2.2生存素Shrna重组质粒的合成与提取.......38[/比尔/] 3.2.3建立聚合酶链反应(实时聚合酶链反应方法.......38[/比尔/] 3.2.4实时聚合酶链反应方法选择最佳生存素.......40
3.2.5壳聚糖-硬脂酸接枝物/蛋白质/pshsur.......40
3 . 2 . 6 MCF-7细胞化学敏感性的评价.......41
3.2.7至MCF-7/Adr细胞耐药性逆转评估.......41
3.3结果和讨论.......41
3.3.1实时聚合酶链反应的建立.......41
3.3.2最佳生存素shRNA重组质粒的筛选……43
3.3.3壳聚糖-硬脂酸接枝物/蛋白质/pshsur.......44
3.4概述.......47
4结论.......49

结论

本研究的主要成果如下:
1。壳聚糖的疏水改性通过碳二亚胺介导实现,得到两亲性壳聚糖-硬脂酸接枝物。核磁共振氢谱证实了壳聚糖-硬脂酸接枝物的化学组成。接枝物的氨基取代度为7.4%,易于在水中自组装成胺束。临界胶束浓度为81.0,水溶液中浓度为1毫克/毫升的接枝物胶束大小为36.4±0.9纳米,电位为32.7±1.2毫伏?胶束呈球形,分布均匀。
2。乙酰氯催化合成了等电点分别为4.7、6.0和9.3的牛血清白蛋白。接枝胶束能有效地结合质粒脱氧核糖核酸,在造粒后形成均匀的二元复合物。共孵育制备了壳聚糖-水杨酸/牛血清白蛋白(4.7)/脱氧核糖核酸、壳聚糖-水杨酸/牛血清白蛋白(6.0)/脱氧核糖核酸、壳聚糖-水杨酸/牛血清白蛋白(9.3)/脱氧核糖核酸的三元配合物。当牛血清白蛋白含量较低时,三元配合物的粒径与二元配合物的粒径相差不大,均小于200纳米。当WbsaA^cs-sa比从0.1增加到0.5时,移植物仍能有效地紧密结合DNA。体外基因转染结果表明,牛血清白蛋白的等电点显著影响移植物介导的基因转染效率。与二元复合物相比,壳聚糖-水杨酸/牛血清白蛋白(6.0)/脱氧核糖核酸三元复合物的基因转染效率略有提高。CS-SA/BSA(4.7)基因转染效果进一步增强,接近脂质体转染的阳性结果?2000年控制;然而,铯-水杨酸/牛血清白蛋白(9.3)/脱氧核糖核酸抑制了转染效率。利用等电点为4.7的牛血清白蛋白来提高基因转染效率,在于其负电荷特性来促进基因药物的释放。
3。本研究建立了准确可靠的实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time-PCR)方法,并通过Real-PCR筛选出最佳干扰质粒。三元复合给药系统基因治疗联合紫杉醇化疗的研究结果表明,基因治疗可有效提高耐药细胞MCF-7/Adr对紫杉醇的敏感性,其逆转耐药倍数为9倍,但对敏感细胞MCF-7无明显影响。

参考文献
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