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73610字博士毕业论文酿酒酵母降低黄酒中氨基甲酸乙酯的代谢工程改进

论文类型:博士毕业论文
论文字数:73610字
论点:菌株,酵母,代谢
论文概述:

本文是博士毕业论文,本文尝试通过对尿素代谢相关调控途径的代谢改造,降低模式菌株发酵过程中的尿素积累量。

论文正文:

第一章引言

随着欧共体的广泛使用,其致癌性也很快被发现。1943年,荨麻和其他人发现,在小鼠[6]中,内皮细胞可以导致细胞癌变和肿瘤形成。从那以后,在许多模型动物(大鼠、小鼠、仓鼠和猴子等)中证实了乳油的致癌性。)。基于这些实验结果,欧共体被认为是对人类具有潜在致癌性的物质,并于1974年被国际癌症研究机构(IARC)归类为2B类致癌化合物。自那以后,研究人员发现欧共体也能直接诱发人类肝癌[7号,这进一步促使IARC在2007年将欧共体的致癌水平从2B提高到2A(与甲醛水平相同)。目前,电子商务只能用于科学研究。对大多数人来说,酒精饮料和发酵食品是日常生活中联系电子商务最简单的方式。然而,由于电子商务检测技术的限制,直到1976年,Ough才首次报告酒精饮料中的电子商务含量,[8]。随着分析技术的发展和提高,许多酒精饮料和发酵食品中的低含量电子商务也逐渐被检测出来。近年来,研究人员测试了世界各地各种酒精饮料的电子商务含量(表1-1)。试验结果表明,大多数啤酒和麦芽饮料中未检出乳油,或其含量极低。高酒精白兰地的平均含量为1073× 10-9 GL-1。黄酒和葡萄酒的平均酶含量分别为20-300×10-9 g/L和7-12× 10-9 GL-1 [9]。
……

第二章酿酒酵母N85菌株

2.1序言
本章首先考察酿酒酵母N85菌株在人工合成复合氮源培养基中对各种氮源的利用,找出N85菌株优选的几种氮源;结合以往文献,分别检测了这些氮源对N85菌株尿素利用的影响,并选择了对N85菌株尿素利用抑制最明显的氮源。利用定量聚合酶链反应技术,寻找抑制N85菌株尿素利用的关键调控途径和因素。根据这些实验结果,提出了首选氮源对尿素代谢抑制作用的机理。利用绿色荧光蛋白融合表达技术研究了优选氮源对发现的调控因子胞内定位的影响,验证了抑制机制的正确性。

2.2材料与方法
20种常见氨基酸、硫酸铵、氨苄西林、蛋白酶K、溶菌酶、YNB合成培养基(不含氨基酸和硫酸铵)和质粒少量提取试剂盒购自上海龚升生物工程有限公司;酵母基因组提取试剂盒和总核糖核酸提取试剂盒均购自恰根公司。脱氧核糖核酸标记、限制性内切酶、T4脱氧核糖核酸连接酶、大肠杆菌能力制备试剂盒、脱氧核糖核酸凝胶回收试剂盒、核糖核酸逆转录试剂盒引物ⅱ第一链cdna合成试剂盒、定量聚合酶链反应试剂盒?预混合Ex Taq?(完美实时)从TaKaRa公司购买;酵母转化试剂盒快吗?酵母转化是从生物科学公司购买的。在YPD培养中,酵母细胞在30℃ (200 Rmin-1)活化20小时,然后转移到YNB培养基(分别加入特异性检测氮源),在30℃ (200 Rmin-1)培养10小时。离心收集酵母,立即在液氮中研磨,使用酵母总核糖核酸提取试剂盒获得酵母总核糖核酸。然后从核糖核酸逆转录试剂盒中制备CDNA。使用获得的酵母cDNA作为模板,设计引物用于快速定量聚合酶链反应(见表2-4)。实验采用ACT1基因作为内部参考基因,2-??[116】。只有表达变化超过2倍的基因才被认为发生了显著变化。

第三章GATA调节因子在酿酒酵母氮代谢中的细胞内定位............................32
3.1前言..............................32
3.2材料和方法............................33[/溴/] 3.3结果和讨论...................35
第四章代谢修饰NCR调节因子减少酿酒酵母模型菌株尿素积累..............................41
4.1前言............................41
4.2材料和方法..............................41
第五章尿素代谢调节途径的代谢修饰减少酿酒酵母模型菌株中尿素的积累……49
5.1前言................49[/比尔/] 5.2材料和方法...................50
5.3结果和讨论.........................................52

第6章代谢工程转化酿酒酵母N85菌株降低黄酒模拟系统

序言6.1
在第4章和第5章中,尝试了多种转化策略来提高该菌株的尿素代谢能力。虽然有一些策略效果不明显(如磷酸酶的表达),但大多数策略都能有效减少模型菌株发酵过程中尿素的积累。因此,这些策略(包括Gln3p和Gat1p的修饰、Dal81p和Dal82p的过表达等。)具有应用于酿酒酵母N85生产菌株代谢修饰的潜力。然而,由于酿酒酵母菌株的差异,适用于模型菌株的转化策略在N85菌株中是否可行是本章要解决的关键问题。在本章中,从酿酒酵母N85的二倍体生产菌株开始,首先分离N85的单倍体菌株,并进一步添加用于代谢转化的遗传标记。在此基础上,我在前两章的转换策略中选择了几种效果较好的转换策略,并试图从中选择最佳的方法。最后,测试了经修饰的基因工程菌株的发酵特性,以确保代谢工程修饰不会显著影响N85菌株的生产特性。

6.2材料和方法
从产孢培养基中选择少量已经形成子囊孢子的菌落,并用无菌生理盐水稀释,形成浓度为107-108细胞/毫升的细菌悬浮液。细菌悬液中加入0.3 GL-1蜗牛酶,在30℃处理10分钟,去除细胞的血管壁。取一点酶解后的细菌悬液,涂在YPD平板的一侧,用显微操作器小心地挑出在血管破裂后释放到平板另一侧的四个孢子(图6-1)。YPD平板在30℃培养2-4天。在单孢子细胞形成菌落后,根据文献中的方法[142检测分裂菌株的单体型。在检测和确认后,分离的N85单倍体菌株被保存用于随后的实验。
……

主要结论和前景[/BR/]

(1)在Gln3p和Gat1p核定位研究的基础上,进行了一系列代谢修饰(磷酸化位点的位点特异性突变、核定位调控序列缺失等)。)已经尝试使用不同的策略。实验结果表明,这些策略可以在一定程度上缓解,并且这些策略的组合可以获得最佳的转化效果。此外,还将进一步尝试提高代谢修饰的效果。实验结果表明,尽管Ure2p的敲除对增强Gln3p和Gat1p的活性有显著作用,但会产生很强的抑制作用,这种策略不能应用于生产菌株的代谢修饰。
(2)通过尿素代谢相关调节途径的代谢修饰,尝试减少模型菌株发酵过程中尿素的积累。实验结果表明,去磷酸化的调节作用有限。增强的活化可以增强菌株的尿素代谢能力。此外,Dal81p上的泛素化位点是位点特异性突变的。
通过对酿酒酵母氮代谢抑制作用的研究,找到了尿素代谢抑制的一些调控途径和关键调控因子。然而,由于酿酒酵母复杂的氮代谢调控网络,仍有许多未知的调控途径和因素有待发现。因此,在后续研究中,可以利用基因组学、转录组学等高通量测序技术对酿酒酵母的氮代谢网络进行综合分析,获得越来越准确的代谢调控模型。
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参考文献(省略)