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论文范文探讨siRNAs在基因治疗中的应用

论文类型:论文范文
论文字数:
论点:基因,沉默,表达
论文概述:

这篇论文主要从siRNAs的沉默机制、基因沉默效率及其安全性、表达载体、在活体中的应用几个方面来介绍siRNAs在基因治疗中的应用以及它的重要性。本论文由硕博论文网博士论文中心生

论文正文:

前言:本文主要从siRNAs的沉默机制、基因沉默效率及其安全性、表达载体和体内应用等几个方面介绍了siRNAs在基因治疗中的应用及其重要性。本论文由硕博论文网博士论文中心生物论文频道组织推荐。

探讨siRNAs在基因治疗中的应用

简介:小干扰核糖核酸(siRNAs)是核糖核酸干扰(RNAi)过程中的效应分子。Fire等人[1]于1998年将核糖核酸(双链核糖核酸)注入李秀香隐孢子虫。分子降解细胞质中含有同源序列的靶基因。随后的研究表明,RNAi现象广泛存在于大多数真核生物中,如真菌、拟南芥、斑马鱼、果蝇、小鼠和大鼠。在哺乳动物细胞中早期应用长dsRNA会引起非特异性干扰素反应,导致细胞死亡。后来,基因和生化研究证明,将dsRNA切割成21-28个核苷酸的siRNAs不会引起干扰素反应,并能有效降解含有同源序列的靶基因。因此,siRNAs正迅速发展成为研究基因功能的新工具和新的治疗方法。

1.siRNAs [/BR/] Sirnas的沉默机制是在切割细胞质中天然存在的长dsRNA的过程中,由核糖核酸酶-ⅲ家族中称为Dicer的内切核酸酶产生的。Dicer将长dsRNA切割成21-28个核苷酸的siRNA双链。这个siRNA双链由5’端的磷酸盐和3’端的羟基组成。3’端也有一个由2个核苷酸组成的突出端。siRNA双链与核糖核酸诱导的沉默复合物结合后被切割成siRNA单链,与siRNA单链完全互补的同源靶基因被核糖核酸诱导的沉默复合物剪切并降解。从而达到基因沉默的目的。siRNA现在可以通过化学合成或双链发夹样核糖核酸(shRNA)的表达,通过核酶等载体进入细胞,核酶可以在细胞中转化为siRNA,发挥基因沉默作用。一些研究已经证明siRNAs具有其他沉默机制,例如在一些生物体中通过RNAi途径修饰细胞染色质引起转录水平的基因沉默[2-3]。

微小核糖核酸(miRNAs)是一类非编码小分子核糖核酸,具有与小核糖核酸相似的功能。调节细胞中的基因表达。成熟miRNA是由细胞质中70个核苷酸组成的发夹状结构前体组成的单链,被切割成21-22个核苷酸分子。当它们被组装成蛋白质复合物(miRNP)后,它们与核糖体中3’端的非翻译区互补并结合,以防止mRNA翻译。如果它们完全互补并与同源靶基因相结合,miRNAs,像siRNAs一样,可以通过正反馈途径循环降解靶基因。

2.sirnas的基因沉默效率和安全性
各种基因沉默方法能否有效作用于靶目标仍然是siRNAs应用于治疗的关键问题。哈伯思等人[4]研究表明,核糖核酸结合蛋白、核糖核酸的二级和三级结构可以影响siRNA的沉默效率。大多数研究已经证实siRNAs比各种寡脱氧核苷酸更有效。表演时间更长。作用于相同靶位的siRNAs的半最大抑制浓度(IC50)比磷酰基修饰的ODNs低100-1000倍。虽然siRNAs和核酶和/或脱氧核糖核酸酶的效率尚未得到广泛和系统的比较,但drew等人[5]研究表明,siRNAs比核酶和/或脱氧核糖核酸酶更有效,具有长发夹结构的核糖核酸比具有锤头结构的核酶更能抑制靶基因的表达。

低浓度的siRNAs可以启动基因沉默的过程,因为它们可以快速而特异地与RISC结合,从而降低与非特异性蛋白质结合的可能性。这有助于减少siRNAs在治疗中的非特异性反应。事实上,一些研究已经证明转染中等浓度的siRNAs不会引起系统的非特异性反应[6]。[7-9]也有三项研究认为,siRNAs引起的非特异性反应与siRNAs的浓度、细胞类型、转染试剂和转染方法有关。这些非特异性反应包括刺激基因亚型引起的干扰素反应,但是研究并不像预期的那样,并且产生的干扰素反应不影响细胞生长。

3.siRNAs的表达载体[/BR/]因为siRNAs可以通过化学合成获得或通过载体表达,所以将靶向药物应用于基因治疗是可能的。表达siRNAs的载体通常含有核糖核酸聚合酶ⅲ启动子(核糖核酸聚合酶ⅲ启动子,Poliii)或核糖核酸聚合酶ⅱ启动子(Poli)序列,首先转录产生类似miRNA前体的shRNA,然后在细胞中变成siRNA,发挥基因沉默作用。siRNA表达载体在活体和培养组织细胞中的应用可以长时间整合到基因组中,并“敲除”内源基因。许多研究已经证明腺病毒载体、腺相关病毒、AAV)载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体可以有效转染入活体和培养细胞。Shinagawa等人表达siRNAs的病毒载体为研究哺乳动物的基因功能提供了新的方法,为人类主要疾病的治疗带来了新的希望。已经设计了几种病毒来表达siRNAs。重组AAV能在哺乳动物细胞有丝分裂期和静止期长时间表达siRNA。它们通常以附属物的形式随机和低频整合到宿主基因组中。血浆中的SiRNAs双链可以抵抗核酸内切酶的降解,但这并不意味着它可以稳定地存在于体内。因为未修饰的siRNAs不能快速进入细胞或与血浆蛋白的亲和力低,可以被机体更早清除。如果不是为了表达siRNAs载体,那么siRNAs必须进行化学修饰,以便作为基因治疗的一种手段更加有效。一些研究[19-20]正在通过硫酰修饰的siRNA提高细胞的摄取能力,从而增强基因沉默的效果。去年,美国食品和药物管理局批准了用于临床新药试验的改良siRNAs。对于年龄相关性黄斑变性患者的治疗,[21]。最近苏特切克等人[22]经大鼠尾静脉注射胆固醇修饰的抗apoB siRNA能有效抑制同源靶基因的过表达。还证实了修饰的抗apoB siRNA将小鼠的胆固醇水平降低到与apoB基因敲除小鼠相似的水平,这实现了siRNA作为静脉治疗药物的可能性。的研究表明,将表达siRNA的AAV载体注射到大鼠大脑中可以导致长达7周的基因沉默效应。在感染艾滋病毒的组织模型中表达的siRNA病毒载体也已成功应用于[的治疗。研究表明,含有pol II的表达载体可以在体内产生由数百个碱基对组成的shRNA,而不会诱导非特异性干扰素反应,这为siRNAs应用于哺乳动物提供了一种安全的新方法。

4.siRNAs在活体中的应用
化学合成的siRNAs已通过电穿孔、局部注射或静脉注射成功合成。将表达siRNAs的质粒和表达siRNAs的病毒引入哺乳动物细胞。然而,很难评估哪种方法能更有效地引起基因沉默。通过大鼠尾静脉静脉注射siRNA,成功地将溶于生理盐水中的siRNA导入大鼠组织。肝脏中靶基因的沉默效率超过90%,而肺、肾、脾和胰腺中的沉默效率略低于[11-12]。这种方法引起的基因沉默效应通常持续几天,在某些情况下可超过1周,基因沉默效率因物种而异。

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现在有几种新方法将siRNAs引入活体。最近的研究参考资料:
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5.基于siRNAs的基因治疗
虽然siRNA在哺乳动物细胞中仅使用了4年,但它正在迅速发展成为一种新的基因治疗方法。如果siRNAs能通过尾静脉高压注射有效到达肝脏,它将被广泛用于治疗各种肝病。通过沉默肝脏内源性凋亡基因的表达,用抗凋亡酶Caspase-8或针对Fas细胞死亡受体的siRNAs预处理的小鼠可有效预防各种试剂诱导的急性肝功能衰竭;同样的siRNA也可以用来治疗[11-12]发生的肝损伤。siRNAs可以通过抑制病毒本身或抑制病毒转录所需的辅助因子来达到抗病毒的目的。乙型肝炎病毒(HBV)基因组和siRNAs的共转染可有效降低HBV·[的复制水平和蛋白质合成。wohlbold等人[18]已证明siRNAs能有效沉默异常的BCR-ABL融合基因表达,而不影响正常的c-BCR和c-ABL转录,为治疗Ph染色体阳性的慢性髓系白血病提供了新的方法。

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SiRNAs作为一种新的基因治疗方法引起了许多研究者的兴趣,主要是因为它作为细胞内源性基因表达调节剂的低毒性和特异性,另一方面,它比ODNs和核酶具有更强的基因沉默效率。然而,将Sirnas应用于临床治疗仍然存在一些挑战,例如将siRNAs引入细胞的最佳方法以及如何获得更高的效率。如何避免靶漏现象和非特异性反应?因此,进一步深入研究RNAi机制将丰富我们对基因表达调控的理解,也将有利于基因治疗的实际应用。

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