论文范文探讨siRNAs在基因治疗中的应用
论文类型：论文范文
论文字数：
论点：基因,沉默,表达
论文概述：
这篇论文主要从siRNAs的沉默机制、基因沉默效率及其安全性、表达载体、在活体中的应用几个方面来介绍siRNAs在基因治疗中的应用以及它的重要性。本论文由硕博论文网博士论文中心生
论文正文：
前言:本文主要从siRNAs的沉默机制、基因沉默效率及其安全性、表达载体和体内应用等几个方面介绍了siRNAs在基因治疗中的应用及其重要性。本论文由硕博论文网博士论文中心生物论文频道组织推荐。
探讨siRNAs在基因治疗中的应用
简介:小干扰核糖核酸(siRNAs)是核糖核酸干扰(RNAi)过程中的效应分子。Fire等人[1]于1998年将核糖核酸(双链核糖核酸)注入李秀香隐孢子虫。分子降解细胞质中含有同源序列的靶基因。随后的研究表明，RNAi现象广泛存在于大多数真核生物中，如真菌、拟南芥、斑马鱼、果蝇、小鼠和大鼠。在哺乳动物细胞中早期应用长dsRNA会引起非特异性干扰素反应，导致细胞死亡。后来，基因和生化研究证明，将dsRNA切割成21-28个核苷酸的siRNAs不会引起干扰素反应，并能有效降解含有同源序列的靶基因。因此，siRNAs正迅速发展成为研究基因功能的新工具和新的治疗方法。
1.siRNAs [/BR/] Sirnas的沉默机制是在切割细胞质中天然存在的长dsRNA的过程中，由核糖核酸酶-ⅲ家族中称为Dicer的内切核酸酶产生的。Dicer将长dsRNA切割成21-28个核苷酸的siRNA双链。这个siRNA双链由5’端的磷酸盐和3’端的羟基组成。3’端也有一个由2个核苷酸组成的突出端。siRNA双链与核糖核酸诱导的沉默复合物结合后被切割成siRNA单链，与siRNA单链完全互补的同源靶基因被核糖核酸诱导的沉默复合物剪切并降解。从而达到基因沉默的目的。siRNA现在可以通过化学合成或双链发夹样核糖核酸(shRNA)的表达，通过核酶等载体进入细胞，核酶可以在细胞中转化为siRNA，发挥基因沉默作用。一些研究已经证明siRNAs具有其他沉默机制，例如在一些生物体中通过RNAi途径修饰细胞染色质引起转录水平的基因沉默[2-3]。
微小核糖核酸(miRNAs)是一类非编码小分子核糖核酸，具有与小核糖核酸相似的功能。调节细胞中的基因表达。成熟miRNA是由细胞质中70个核苷酸组成的发夹状结构前体组成的单链，被切割成21-22个核苷酸分子。当它们被组装成蛋白质复合物(miRNP)后，它们与核糖体中3’端的非翻译区互补并结合，以防止mRNA翻译。如果它们完全互补并与同源靶基因相结合，miRNAs，像siRNAs一样，可以通过正反馈途径循环降解靶基因。
2.sirnas的基因沉默效率和安全性
各种基因沉默方法能否有效作用于靶目标仍然是siRNAs应用于治疗的关键问题。哈伯思等人[4]研究表明，核糖核酸结合蛋白、核糖核酸的二级和三级结构可以影响siRNA的沉默效率。大多数研究已经证实siRNAs比各种寡脱氧核苷酸更有效。表演时间更长。作用于相同靶位的siRNAs的半最大抑制浓度(IC50)比磷酰基修饰的ODNs低100-1000倍。虽然siRNAs和核酶和/或脱氧核糖核酸酶的效率尚未得到广泛和系统的比较，但drew等人[5]研究表明，siRNAs比核酶和/或脱氧核糖核酸酶更有效，具有长发夹结构的核糖核酸比具有锤头结构的核酶更能抑制靶基因的表达。
低浓度的siRNAs可以启动基因沉默的过程，因为它们可以快速而特异地与RISC结合，从而降低与非特异性蛋白质结合的可能性。这有助于减少siRNAs在治疗中的非特异性反应。事实上，一些研究已经证明转染中等浓度的siRNAs不会引起系统的非特异性反应[6]。[7-9]也有三项研究认为，siRNAs引起的非特异性反应与siRNAs的浓度、细胞类型、转染试剂和转染方法有关。这些非特异性反应包括刺激基因亚型引起的干扰素反应，但是研究并不像预期的那样，并且产生的干扰素反应不影响细胞生长。
3.siRNAs的表达载体[/BR/]因为siRNAs可以通过化学合成获得或通过载体表达，所以将靶向药物应用于基因治疗是可能的。表达siRNAs的载体通常含有核糖核酸聚合酶ⅲ启动子(核糖核酸聚合酶ⅲ启动子，Poliii)或核糖核酸聚合酶ⅱ启动子(Poli)序列，首先转录产生类似miRNA前体的shRNA，然后在细胞中变成siRNA，发挥基因沉默作用。siRNA表达载体在活体和培养组织细胞中的应用可以长时间整合到基因组中，并“敲除”内源基因。许多研究已经证明腺病毒载体、腺相关病毒、AAV)载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体可以有效转染入活体和培养细胞。Shinagawa等人表达siRNAs的病毒载体为研究哺乳动物的基因功能提供了新的方法，为人类主要疾病的治疗带来了新的希望。已经设计了几种病毒来表达siRNAs。重组AAV能在哺乳动物细胞有丝分裂期和静止期长时间表达siRNA。它们通常以附属物的形式随机和低频整合到宿主基因组中。血浆中的SiRNAs双链可以抵抗核酸内切酶的降解，但这并不意味着它可以稳定地存在于体内。因为未修饰的siRNAs不能快速进入细胞或与血浆蛋白的亲和力低，可以被机体更早清除。如果不是为了表达siRNAs载体，那么siRNAs必须进行化学修饰，以便作为基因治疗的一种手段更加有效。一些研究[19-20]正在通过硫酰修饰的siRNA提高细胞的摄取能力，从而增强基因沉默的效果。去年，美国食品和药物管理局批准了用于临床新药试验的改良siRNAs。对于年龄相关性黄斑变性患者的治疗，[21]。最近苏特切克等人[22]经大鼠尾静脉注射胆固醇修饰的抗apoB siRNA能有效抑制同源靶基因的过表达。还证实了修饰的抗apoB siRNA将小鼠的胆固醇水平降低到与apoB基因敲除小鼠相似的水平，这实现了siRNA作为静脉治疗药物的可能性。的研究表明，将表达siRNA的AAV载体注射到大鼠大脑中可以导致长达7周的基因沉默效应。在感染艾滋病毒的组织模型中表达的siRNA病毒载体也已成功应用于[的治疗。研究表明，含有pol II的表达载体可以在体内产生由数百个碱基对组成的shRNA，而不会诱导非特异性干扰素反应，这为siRNAs应用于哺乳动物提供了一种安全的新方法。
4.siRNAs在活体中的应用
化学合成的siRNAs已通过电穿孔、局部注射或静脉注射成功合成。将表达siRNAs的质粒和表达siRNAs的病毒引入哺乳动物细胞。然而，很难评估哪种方法能更有效地引起基因沉默。通过大鼠尾静脉静脉注射siRNA，成功地将溶于生理盐水中的siRNA导入大鼠组织。肝脏中靶基因的沉默效率超过90%，而肺、肾、脾和胰腺中的沉默效率略低于[11-12]。这种方法引起的基因沉默效应通常持续几天，在某些情况下可超过1周，基因沉默效率因物种而异。
[10]
现在有几种新方法将siRNAs引入活体。最近的研究参考资料:
1，firea，xus，montgomery mk，kostasa，driversee，Mello CC。秀丽隐杆线虫双链核糖核酸的有效和特异性遗传干扰。《1998年自然》；391:806-811
2、费尔德尔·阿、贾·斯、戈贝尔·斯、杉山·特、吉·斯、格雷瓦尔·西、莫泽德·核糖核酸介导的RITS复合体异染色质靶向。科学2004；303:672-676
3、Pal-Bhara M、Leibovitch BA、Gandhi SG、Rao M、Bhadra U、Birchler JA、Elgin SC。果蝇的异染色质沉默和HP1定位依赖于RNAi机制。科学2004；303:669-672
4、哈伯思·J、厄尔巴希·SM、范登伯格·K、曼宁加·H、斯卡灵格·萨、韦伯·K、图施勒·T .小干扰核糖核酸和发夹核糖核酸的序列、化学和结构变异及其对哺乳动物基因沉默的影响。反义核酸药物开发2003；13:83-105
5、德鲁·赫尔、路易·戴、柯纳蒂·杰、兰德·凯恩、亨德利·普、洛科特·特纳发夹环比锤头状核酶更能抑制蛋白质合成。《欧洲生物化学》，1999年；266:260-273
6、塞米扎罗夫·德、弗罗斯特·L、萨尔蒂·阿、克鲁格·P、哈尔伯特·DN、费西克·西南。通过基因表达信号确定短干扰核糖核酸的特异性。美国国家科学院学报2003；小干扰核糖核酸对哺乳动物基因表达的非特异性、浓度依赖性刺激和抑制。RNA 200410:12-18
8、加州雪橇、霍尔科姆、德维尔姆吉、右侧希尔弗曼、威廉姆斯br。短干扰RNAs激活干扰素系统。Nat Cell Biol 20035:834-839
9、桥梁AJ、伯纳德·斯、杜克劳、尼古拉斯·艾尔、伊戈·雷。哺乳动物细胞中核糖核酸载体诱导干扰素应答。Nat Genet 200334:263-264
10、石井川.通过表达来自核糖核酸聚合酶ⅱ启动子的长双链核糖核酸来产生滑雪击倒小鼠。基因开发2003；17:1340-1345
11、曾德勒、胡克、利特克、蒂尔曼、曾德勒、蒙特卜、沃尔德马、戈斯林、弗莱明、马利克、特劳特魏因、曼恩斯议员、库尼勒、库比卡·卡斯帕酶8小干扰核糖核酸可预防小鼠急性肝功能衰竭。美国国家科学院学报2003；100:7797-7802
12、宋娥、李斯克、王杰、因斯·恩、欧阳恩、闵杰、陈杰、尚卡尔·普、利伯曼·核糖核酸干扰靶向Fas保护小鼠免于暴发性肝炎。Nat Med 20039:347-351
13、霍姆斯·京德、西尔斯·RM、乔治·斯库·丁、西蒙斯·德尔、迪伦·RJ。利用病毒介导的核糖核酸干扰在大脑中敲除局部基因。Nat Med 20039:1539-1544
14，科隆佐治亚州科伯恩。通过核糖核酸干扰对人类免疫缺陷病毒1型复制的有效和特异性抑制。J Virol 2002通过高通量筛选发现透皮渗透促进剂。Nat Biotechnol，2004年；22:192-197
16、高塔姆、丹斯莫尔、许博、瓦尔代普JC。PEI-脱氧核糖核酸气雾剂给药后小鼠肺基因表达增强。Mol Ther 20002:63-70
17、克莱因、伯克、韦德迈、伍斯特菲尔德、洛迦尼、迪恩斯惠普、库比卡、曼恩斯议员、特劳特魏因。核苷类似物和siRNA抑制体内乙型肝炎病毒复制。胃肠病学2003；125:9-18
18、沃博尔德·勒、范德奎普·赫、米西特·C、沃伦罗彻·惠普、克纳贝·C、杜伊斯特·J、奥立兹基·韦。甲磺酸伊马替尼(STI571)小干扰核糖核酸增敏剂抑制bcr-abl基因表达。《血2003》；102:2236-2239
19、乔德娜·弗、费希特纳·米、达姆斯、艾京·赫、克利珀勒·阿、普龙克·GJ、吉斯·克、考夫曼·杰。哺乳动物细胞中合成siRNAs的结构变化和稳定化修饰。核酸决议2003；31:2705-2716
20、布拉什·达、詹森·S、刘Y、考尔·K、阿拉尔·K、怀特·马、科里·dr .核糖核酸通过化学修饰的核糖核酸干扰哺乳动物细胞。生物化学2003；42:7967-7975
21，卡拉扬尼斯烟草公司，东印度公司。核糖核酸干扰和短干扰核糖核酸的潜在治疗应用。癌症基因Ther 20055月13日:[·埃普布印刷前]
22、苏特切克·杰、阿基NC·阿、布拉姆拉杰·布、查里斯·凯、康斯坦斯·R、多诺霍·姆、厄尔巴希·S、盖克·A、哈德威格·P、哈珀斯·杰、约翰·M、凯萨万·V、拉文·G、潘迪·RK、拉西特、拉吉耶夫·KG、罗尔·I、图贾尔斯卡·伊、王格、乌什科、布姆克罗托、科特连斯基·V、利默、马诺哈兰通过系统施用修饰的siRNAs治疗性沉默内源性基因。自然2004；432:173-178表明大分子可以促进几个小分子的经皮吸收，包括siRNAs分子。这将促进siRNAs经皮吸收到全身血液循环中，从而发挥治疗药物的作用。将含有siRNAs的气雾剂引入肺部也可以起到基因治疗的作用，[16]。
5.基于siRNAs的基因治疗
虽然siRNA在哺乳动物细胞中仅使用了4年，但它正在迅速发展成为一种新的基因治疗方法。如果siRNAs能通过尾静脉高压注射有效到达肝脏，它将被广泛用于治疗各种肝病。通过沉默肝脏内源性凋亡基因的表达，用抗凋亡酶Caspase-8或针对Fas细胞死亡受体的siRNAs预处理的小鼠可有效预防各种试剂诱导的急性肝功能衰竭；同样的siRNA也可以用来治疗[11-12]发生的肝损伤。siRNAs可以通过抑制病毒本身或抑制病毒转录所需的辅助因子来达到抗病毒的目的。乙型肝炎病毒(HBV)基因组和siRNAs的共转染可有效降低HBV·[的复制水平和蛋白质合成。wohlbold等人[18]已证明siRNAs能有效沉默异常的BCR-ABL融合基因表达，而不影响正常的c-BCR和c-ABL转录，为治疗Ph染色体阳性的慢性髓系白血病提供了新的方法。
[13]
SiRNAs作为一种新的基因治疗方法引起了许多研究者的兴趣，主要是因为它作为细胞内源性基因表达调节剂的低毒性和特异性，另一方面，它比ODNs和核酶具有更强的基因沉默效率。然而，将Sirnas应用于临床治疗仍然存在一些挑战，例如将siRNAs引入细胞的最佳方法以及如何获得更高的效率。如何避免靶漏现象和非特异性反应？因此，进一步深入研究RNAi机制将丰富我们对基因表达调控的理解，也将有利于基因治疗的实际应用。
[15]