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论文范文基因枪法转化水稻的研究

论文类型:论文范文
论文字数:
论点:基因,转化,枪法
论文概述:

作为世界上最要作物的水稻,近些年来对它的研究越来越多,水稻遗传转化研究也越来越受到人们关注。本论文由硕博论文网生物论文频道提供。

论文正文:

前言:水稻作为世界上最重要的作物,近年来受到越来越多的研究,水稻遗传转化的研究也越来越受到重视。本论文由硕博论文网生物论文频道提供。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一。近年来,基因重组技术、基因操作技术和水稻基因图谱的研究取得了显著进展。孟山都公司于2000年4月和先正达公司于2001年2月相继宣布完成粳稻日本晴的基因组测序草图。中国还宣布完成籼稻9311的序列框架。目前,以大规模分离和鉴定基因组序列功能为特征的水稻功能基因组研究发展迅速,这一研究必然依赖于高效的水稻遗传转化体系,因此水稻遗传转化的研究成为关注的焦点。

水稻遗传转化体系相对完善。农杆菌介导法、基因枪法、聚乙二醇法、花粉管通道法等方法已经应用于水稻遗传转化并获得转基因植物,但最常用的方法是基因枪法和农杆菌介导法。农杆菌介导的水稻转化曾因其非农杆菌的天然库而局限于谷类作物。基因枪法已经有了很大的发展,因为它可以有效地转化单子叶和双子叶植物而不受宿主的限制。本文简要综述了基因枪法的基本原理、优缺点、影响水稻基因枪法转化的几个关键因素、外源基因的遗传特性及存在的问题。

1基因枪法的原理和优缺点
1.1基因枪法的原理

Pariclgun也被称为微射弹轰击。基本原理是在微小的金或钨颗粒表面涂上外源性的脱氧核糖核酸,然后在高压作用下,将颗粒高速注入受体细胞或组织。颗粒上的外源基因进入细胞后,整合到植物染色体中进行表达,从而实现基因转化。

1.2基因枪法的优缺点
1.2.1基因枪法的优点

(1)无宿主限制。基因枪法本质上是一个不受宿主限制的物理过程,可以有效转化单子叶和双子叶植物。虽然聚乙二醇转化法、电击法、脂质介导转化法和以原生质体为受体的显微注射法都可用于单子叶植物的转化,但以原生质体为受体材料要求受体系统具有良好的再生性能,这对于大多数谷类作物来说比较困难,其再生周期也比较长,再生过程容易发生变异。

(2)靶受体类型广泛,不受组织类型的限制。几乎所有具有潜在分生组织的组织或细胞都可以被基因枪轰击和转化。目前,用于基因枪转化的受体材料非常广泛,包括原生质体、悬浮细胞、根或茎段、叶盘、成熟胚、未成熟胚、分生组织、愈伤组织、胚芽鞘以及几乎所有具有潜在分化能力的组织或细胞。

(3)可控性高。高压放电或高压气体驱动的基因枪可以根据实验要求将携带外源脱氧核糖核酸的金属颗粒注入特定水平的细胞(如再生区的细胞),使转化后的细胞能够再生植株,从而提高转化频率。

(4)操作简单快捷。农杆菌介导法需要农杆菌感受态细胞的制备、共培养和抑菌,聚乙二醇转化法和电击法需要繁琐的原生质体分离和培养工作,基因枪法是一个物理过程。只要携带外源基因的金属颗粒在无菌条件下被受体材料轰击,就可以进行筛选和培养,操作简单快捷。

1.2.2基因枪法的缺点

由于基因枪轰击的随机性,外源基因进入宿主基因组的整合位点相对不稳定,拷贝数往往很大。因此,转基因后代容易发生突变,外源基因容易丢失,基因沉默等现象容易发生,不利于外源基因在宿主植物中的稳定表达。此外,基因枪既昂贵又操作昂贵。

2影响水稻基因枪转化的几个关键因素[/BR/] 2.1水稻基因型[/BR/]栽培稻主要由籼稻和粳稻组成,其中籼稻是热带和亚热带地区的主要粮食作物。由于籼稻的组织培养特性和再生能力与粳稻有很大不同,在转化过程中籼稻的转化效率明显低于粳稻。李良才等人对14个粳稻品种和23个籼稻品种进行了转化试验。其中,所有粳稻品种均转化为转基因植株,平均转化率约为10%,而只有14个籼稻品种转化为转基因植株,7个籼稻品种转化为转基因愈伤组织,2个籼稻品种没有反应。转基因植株的转化频率仅为2% ~ 3%,明显低于粳稻。

2.2用于基因枪转化的外植体类型
受体材料非常广泛,几乎所有具有潜在分裂和分化能力的组织和细胞都可以用作受体材料,但为了获得理想的转化结果,根据不同水稻品种选择合适的转化受体材料非常关键。目前,最常用的水稻基因枪转化受体材料包括成熟胚、未成熟胚、花药和幼穗。成熟胚胎的选择不受生长季节的限制,因此成为广泛使用的受体材料。然而,一些水稻品种成熟胚盾片愈伤组织的诱导率很低,愈伤组织继代培养过程中经常发生褐变。例如,培矮64S愈伤组织的诱导率不超过50%。对于这样的品种,有必要使用幼穗和幼胚作为受体材料。

2.3组织培养条件
组织培养条件影响水稻转化效率。水稻愈伤组织培养一般采用甲基溴培养基、铌培养基、N6培养基和甲基溴培养基。易黎姿等人认为,在培养基中添加2.5 ~ 5.0毫克/升脱落酸能有效提高水稻愈伤组织的质量。郑虹红等人将受体材料转移到含有一定浓度甘露醇和山梨醇的高渗培养物中,在转化前对受体材料进行处理,可以明显提高GUS基因的时间表达效果和稳定转化的效果。田文仲等人在诱导培养基或继代培养基中加入细胞分裂素(玉米素)和萘乙酸,以及愈伤组织的部分干燥处理,这些措施显著提高了籼稻愈伤组织的再生频率。接种幼胚前低温处理4 d或7 d可提高愈伤组织再生频率,分化培养基中加入脯氨酸和二甲基亚砜(0.12%%二甲基亚砜)可降低愈伤组织褐变率。

2.4基因枪的轰击参数
基因枪的轰击参数包括微型炸弹的类型、微型炸弹的速度、微型炸弹的射程轰击压力、真空室的真空度、轰击次数、脱氧核糖核酸的纯度和浓度、脱氧核糖核酸沉淀剂等因素。

钨粒子首次用于基因枪转化技术。烟草花叶病毒吸附在钨颗粒表面,轰击洋葱表皮细胞。测试表明病毒核糖核酸可以复制。后来,麦凯布(McCabe)(1988)用金粉作为脱氧核糖核酸微粒载体转化成熟大豆胚芽,获得GUS基因的稳定表达。与钨粉相比,金粉对细胞的损伤和毒性比钨粉小,且粒度相同。钨粉更便宜,但它可能对某些细胞有毒。

微型炸弹的运动速度是影响转化率的一个重要因素。不同的速度对受体组织和细胞有不同的穿透力和损伤程度。籼稻和粳稻对微弹的速度要求不同,轰击应根据转化受体材料的特点进行调整。

微弹的射程是指样品室中的靶材料与粒子枪挡板之间的距离,这是影响转化率的一个重要因素。范围越大,穿透力越小。范围越小,渗透越大。刁先民等人指出,在低于400米/秒的轰击速度下,10厘米样品室高度的转换结果明显低于7厘米。

轰击压力也是影响基因轰击转化频率的重要因素。易黎姿等人在6厘米轰击距离、每枪100微克金粉和0.2微克脱氧核糖核酸剂量的条件下,用900磅/平方英寸、1100磅/平方英寸和1300磅/平方英寸三种不同的压力膜转化籼稻愈伤组织。结果表明,900磅/平方英寸压力膜的转化效果最好,平均每盘gus基因瞬时表达最多的蓝点。

转换频率与腔室中的真空度正相关,但是受体材料对真空度只有一定的公差,因此腔室中的真空度受到一定程度的限制。

轰击次数对转换频率有一定影响。易黎姿等人在6厘米轰击距离、100 μg金粉/丸、0.2μg脱氧核糖核酸和900 psi压力膜条件下,对籼稻愈伤组织进行了1、2和3次每盘轰击的比较研究。结果表明,最佳效果是轰击2支枪。然而,薛瑞等人对16个水稻品种进行了一次和两次比较轰炸,发现16个品种之间没有明显差异。

脱氧核糖核酸纯度越高,就越容易获得成功的转化。这是因为当注射到受体细胞中时,高度纯化的脱氧核糖核酸更有可能整合到植物基因组中。

脱氧核糖核酸的浓度也影响基因转化率。过高的浓度很容易导致微球粘附成大块并降低转化频率。目前,粳稻品种常用金粉和质粒脱氧核糖核酸的浓度为500微克/针和1微克/针,但籼稻品种的剂量应减少到1/4至1/8。

氯化钙和亚精胺是常用的脱氧核糖核酸沉淀剂,使脱氧核糖核酸附着在金属颗粒表面。沉淀剂的浓度对转化率有影响。刁先民等人在其他轰击参数保持不变的情况下,分别进行了不同浓度氯化钙和不同浓度亚精胺对gus基因瞬时表达的影响。结果表明,0.5 ~ 1.5摩尔/升氯化钙和30 ~ 50摩尔/升亚精胺的转化率最高。

2.5[/BR/]型筛选剂在植物基因转化中,外源基因稳定整合的频率较低。如何选择合适的筛选标记来准确有效地区分转化细胞和非转化细胞,并产生选择压力,使非转化细胞在不干扰细胞正常生长和植物再生的情况下无法生长,是转化成功的重要环节之一。水稻转化实验中较早使用的选择标记基因是新霉素磷酸转移酶基因(NPT),它对卡那霉素具有抗性。然而,由于水稻对卡那霉素具有天然抗性,因此尚未得到广泛应用。G418是接近卡那霉素诱饵的氨基糖苷类抗生素,不能被新霉素磷酸转移酶激活。它作为选择标记比卡那霉素更有效,并且具有更高的绿苗再生频率。现在bar作为一种选择基因也被用于水稻遗传转化研究。潮霉素磷酸转移酶(HPTⅱ)基因是另一种应用广泛且更有效的标记基因。它对潮霉素具有抗性,潮霉素可用于清楚地区分转化和未转化的组织。不同选择器的使用浓度和选择时间应根据不同材料的具体情况确定。马田冰等人报道,通过调整潮霉素的施用浓度,提高了抗虫转基因水稻研究中的筛选率。结果表明,筛选过程中潮霉素的施用浓度为20 ~ 30毫克/升。当潮霉素用量为15 ~ 25毫克/升时,可获得较高的抗性愈伤组织筛选率和绿苗分化率。

3粒子轰击转化外源基因的遗传特征[/Br/]粒子轰击转化是通过物理方法将裸脱氧核糖核酸随机引入植物受体细胞。其有序性和量化性差,整合机制不明确。外源基因有许多整合位点,可以整合在一条染色体或不同染色体上的多个位点。整合的外源基因容易发生结构变化和修饰,如丢失、环化甲基化等。整合外源基因的拷贝数也很大,多拷贝的比例相对较高。整合外源基因的遗传效应相对复杂,基因间的位置效应和共抑制作用明显。外源基因的整合具有许多遗传特征,转基因植物表型丰富,F1代植物的分离比例复杂,有些符合经典孟德尔定律,但3: 1分离较少,其遗传速度也较差。唐作顺等人通过基因枪法将潮霉素磷酸转移酶基因导入粳稻品种77170,获得转基因植株。自交后代(T1和T2)潮霉素抗性表现为显性单基因位点的遗传模式,符合孟德尔分离定律。陶丽珍等人通过基因枪法将含有HPT基因和GUS基因的质粒pILTAB227导入籼稻品种如巴斯马蒂-1。巴斯马提-1各代hpt基因的遗传和表达分析表明,hpt基因一般以3: 1分离,符合孟德尔单基因控制的遗传规律。同时,也发现一些菌株表现出1∶1的分离,可能是由于基因沉默。永成分别用农杆菌介导法和粒子轰击法将质粒pTOK233和pJPM44转化水稻愈伤组织,获得一批转基因植株。在质粒上分别进行单位点酶消化和双位点酶消化后,用Southern杂交分析总DNA。结果表明,农杆菌介导转化的转基因植株中转基因拷贝数相对较少(平均2.1和2.3),而微喷射轰击转化的转基因植株中转基因拷贝数相对较多(平均4.2和5.6),农杆菌介导转化的转基因植株基因表达盒中的基因重排概率低于微喷射轰击转化的转基因植株——农杆菌介导转化的基因重排概率为0.07和0.106;通过粒子轰击转化的脱氧核糖核酸重排的概率是0.57和0.66。华智华等人通过对低拷贝数转基因植物静音119的连续世代跟踪分析和高世代材料的群体遗传分析表明,共转化基因bar和天蚕素B在基因组中紧密相连,可以稳定遗传和表达。

4粒子轰击的前景粒子轰击辅助农杆菌转化可以提高
转化频率。明哮天等携带普通二元载体的根癌农杆菌EHA105菌株对粳稻中华8号不敏感,转化效率较低,不到5%。用基因枪直接轰击根癌农杆菌细胞进入水稻愈伤组织可以显著提高其转化效率,可达7%以上。赵燕等人还发现,GUS基因结合生物枪法和农杆菌介导法瞬时表达的蓝点数量比单独使用生物枪法和农杆菌介导法分别高出5.48%和12.07%。

基因枪可以将外源基因导入细胞器,并在酵母线粒体和烟草叶绿体中取得了成功。细胞器的遗传系统也起着重要作用。它和核遗传系统相互调节,共同调节细胞的生命活动。基因枪技术提供了将外源基因导入特定组织的可能性,因此可以用于研究植物的发育和调控。如果将外源特异性基因导入不同的细胞或不同的发育阶段,就可以研究基因表达的特征。基因表达的环因子可以通过改变培养条件来研究。

5存在的问题和有待进一步研究的问题
基因枪转化技术自诞生以来取得了可喜的进展,但仍有许多问题有待进一步研究。如果转化率低,籼稻的转化率一般低于1%,而粳稻的转化率较高。目前,它们大多只报道转化后的瞬时表达,但稳定遗传的比例很小,外源基因整合机制等理论问题也不是很清楚。因此,今后需要进一步研究的问题包括:(1)基因枪的可控性、准确性和准确性有待进一步提高;(2)微球的表面结构、大小、均匀性、载药量及制备工艺;(3)不同物种、不同组织和细胞轰击条件;(4)建立高频再生的基因转化受体系统。尽管植物组织培养的研究已有近80年的历史,但高频基因转化受体系统的建立与获得再生植株的常规组织培养仍有很大差距。(5)轰击后进入受体细胞的脱氧核糖核酸的生物学变化及其调控等理论问题。

参考文献:(2)《云南农业大学学报》,第35卷,第5期,2004年;