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40000字硕士毕业论文Omi/HtrA2在口腔鳞状细胞癌中的表达及意义

论文类型:硕士毕业论文
论文字数:40000字
论点:细胞,凋亡,组织
论文概述:

Omi/HtrA2在口腔粘膜异常增生组织中的表达高于正常粘膜组织中的表达(P

论文正文:

前言

   日前越来越多的研究认为,促进肿瘤细胞的凋亡与抑制肿瘤细胞的增殖相比较,前者更为科学。所以寻找相关的生物标志物和基因治疗靶点,对口腔鳞癌患者的早期诊断和治疗及预后十分重要,它可有效提高晚期肿瘤患者的5年生存率,这一观点已被多数学者所公认。    肿瘤的发生、发展与细胞凋亡受阻有重要的关系。细胞凋亡过程是一个生理性的自我毁灭过程,是细胞正常死亡的一种调节形式,它和细胞的生长繁殖是两个截然相反的过程。细胞凋亡又称为细胞程序性死亡,是细胞在外界刺激下通过激活内源性DNA内切酶等自身内部机制,导致细胞死亡的生理过程。细胞凋亡和细胞的分裂繁殖相互作用、相互影响,具有调节细胞群体平衡以及促进细胞自我更新的作用。生理性凋亡过程紊乱,可引起诸如自身免疫性疾病、各种恶性肿瘤以及神经退行性病变等多种疾病。而肿瘤和细胞凋亡之间的联系已成为人们研究的热点,生理性的细胞正常凋亡受阻后,细胞的生存时间被延长,其结果是源源不断产生的突变细胞大量生长,导致身体各种肿瘤的发生。研究发现不同种类的促细胞凋亡的蛋白相互协调才能保证细胞凋亡顺利进行,其中包括最新观察到的定位于线粒体的Omi/HtrA2。其主要通过抑制IAP(凋亡抑制蛋白)家族蛋白发挥促细胞凋亡的作用。    越来越多的学者已开始着手研究Omi/HtrA2与肿瘤以及与细胞凋亡的关系,LEE等[1l研究显示在将近2/3的胃腺癌中Omi/HtrA2呈现高表达,正常胃勃膜细胞的胞浆中末观察到Omi /HtrA2的表达。截止日前,研究人员已经在多种人体肿瘤中检测到Omi/HtrA2的高表达,其中包括:肝癌、乳腺癌、前列腺癌、喉癌、胃癌等人体常见恶性肿瘤。胡晓勇等运用脂质体法将构建的siRNA载体与Omi/HtrA2的表达载体分别转染至pc23细胞中,观察到抗凋亡蛋白PED/PEA215明显受到Omi/HtrA2的抑制,由此可以得出Omi/HtrA2有促进pc23细胞凋亡的作用。以上研究结果提示:Omi/HtrA同以上各种肿瘤的发生和发展有密切的联系。本研究采用免疫组织化学方法和RT-PCR方法检测Omi/HtrA2在口腔鳞状细胞癌组织、癌前病变组织及正常口腔粘膜组织的表达,探讨Omi/HtrA2在口腔鳞状细胞癌的发生发展中的作用,为口腔鳞状细胞癌的早期诊断、早期治疗以及预后的判断提供帮助。
     材料与方法   
1本实验应用的试剂及相关仪器
    Omi/HtrA2鼠抗人单克隆抗体(产品编号:bs-127IR北京博奥森生物技术有限公司)Maxvision2/HRP免疫组化染色试剂盒(福州迈新生物技术有限公司)试剂盒内容:试剂(无色液体):3 %H20:去离子水,过氧化物酶阻断剂(即用型购自福州迈新生物技术有限公司)试剂A:二抗工作液Maxvision2/HRP试剂(即用型购自福州迈新生物技太有仔甩公司)   
2标本选择    选取2010年10月至2011年06月于河北医大第四医院口腔科就诊患者50例,年龄分布在26岁一84岁之间,平均年龄为62.8岁,X60岁者10例,>60岁者40例,其中女性患者21例,男性患者29例;术前取病理已确诊为鳞状细胞癌(部分低分化鳞癌进行了免疫组化确诊),其中高分化者26例,低分化者24例;临床分期工、II期患者共28例,LLI, IV期患者22例,50例鳞癌患者标本分口腔鳞状细胞癌组、癌旁粘膜(距瘤缘2cm)组和正常粘膜(距瘤缘>Scm)组,同时选取2010年10月至2011年06月于河北医大第四医院口腔科就诊的50例口腔粘膜异常增生患者,50例异常增生患者标本记为第4组,以上4组标本均为术后即刻取材,分为两份,其中一份4%福尔马林固定,运用免疫组织化学检测方法检测Omi/HtrA2蛋白在以上各组组织中的表达水平;另一份放于一80度低温冰箱编号保存备用,待应用RT-PCR方法进行Omi/HtrA2在各种组织中基因表达水平的分析。   
3免疫组织化学  厚度定为4}m,石蜡切片机连续切各组石蜡包埋的组织,将切取的各组切片常规脱蜡至水,采用Maxvision2/HRP一步法进行Omi/HtrA2免疫组化染色,其中Omi/HtrA2一抗的抗体浓度为1:200,阴性对照以PB S为一抗,用已知阳性标本作为阳性对照。具体步骤如下:①石蜡切片脱蜡水化,自来水冲洗;②抗原修复:A取适量的已稀释成工作液的柠檬酸修复液(800-1500m1)于压力锅中,将压力锅放置于电磁炉上,大功率至沸腾。B将功率减小至中度(800-1000W),然后将切片置于耐高温的染色架上,加入已沸腾的修复液中,盖上盖,扣上压力阀门,继续加温。C当压力阀门开始喷气的时候开始计时1-2分钟,然后将压力锅从电磁炉上取下。D室温冷却10分钟后,用自来水冲淋压力锅外壁降温,待冷却至室温后去除切片,先利用自来水冲洗干净后,PBS冲洗2次,每次3分钟。③切片上滴加3%过氧化氢(过氧化氢酶阻断剂)室温下孵育10分钟,以消除内源性过氧化物酶活性,PB S冲洗3次,每次3分钟。④除去切片上残余PB S,滴加浓度为1:200的Omi/HtrA2一抗,3 7 0C孵育60分钟,PBS冲洗3次,每次3分钟;⑤除去切片上残余PBS,滴加二抗工作液Maxvision2/HRP试剂,3 7 0C孵育15分钟,PB S冲洗3次,每次3分钟;⑥冲洗除去残余PBS,每张切片上加入新鲜配制的DAB显色剂井在光学显微镜下观察至阳性物质呈棕黄色;⑦自来水冲洗,苏水素复染约3分钟,PB S返蓝,经梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固 
 材料与方法..................... 12-17结果................ 17-19附图.................. 19-23附表 ..................23-26讨论................. 26-31结论 ..........................31............................................   
结语    Omi/HtrA2在口腔鳞状细胞癌组织、癌旁组织及正常口腔粘膜组织中的表达存在显著差异,呈现递减趋势,3组间差异有统计学意义(P