60000字硕士毕业论文我国不同省市酸奶中乳酸菌的药敏分析

论文类型：硕士毕业论文

论文字数：60000字

论点：耐药,乳酸菌,耐药性

论文概述：

近几十年来，由于抗生素在临床上的广泛使用，致病菌的耐药性逐渐增强，这对疾病的预防与治疗带大极大的困难。近年来，致病菌的耐药性已被广泛研究，其耐药机制与耐药基因的转移也多见

论文正文：

第一章文献综述

1.1分子分型技术及其在乳酸菌鉴定和多态性研究中的应用

乳酸菌是一组以碳水化合物为碳源的革兰氏阳性无芽孢细菌，可产生50%以上的乳酸(Konings等人，2000)。乳酸菌种类繁多，具有很高的经济价值，已广泛应用于食品工业、医疗保健、饲料发酵和家畜疾病预防(Furet等人，2004)。不同的产品以不同的方式使用乳酸菌。有些使用自然发酵，如酸菜。有些采用混合菌发酵，如酸奶及其系列产品；也有单菌生产和混合应用，广泛应用于医疗保健、饲料发酵、畜禽疾病防治等。为了了解乳酸菌在这些产品中或使用乳酸菌产品后的动态规律，有必要对不同阶段的乳酸菌进行分离鉴定和定量。其次，乳酸菌耐药性的出现和增加趋势给食品和药品安全带来潜在威胁，因此乳酸菌的应用受到关注。为了保证乳酸菌的应用安全，有必要选择和使用安全菌株。因此，快速鉴定和筛选优良乳酸菌极其重要。乳酸菌的传统分类和鉴定方法是基于乳酸菌的形态、生理生化特性。这种方法不仅耗时费力，而且有时难以有效区分和识别。它已经不能适应当前乳酸菌分类学的快速发展。随着分子生物学技术的不断改进和完善，特别是基于基因组脱氧核糖核酸分析的聚合酶链反应、电泳和核酸测序技术，脱氧核糖核酸分子分型技术以其快速、准确和灵敏的优势逐渐被用于乳酸菌的鉴定(McCartney 2002)。目前，有许多基因分子分型技术应用于乳酸菌的鉴定和多态性研究。摘要:阐述了几种常用的脱氧核糖核酸分子分型技术的原理、步骤、优缺点，并介绍了近年来它们在乳酸菌中的应用，以期为乳酸菌的鉴定和多态性研究提供一些帮助。

1.2细菌药敏试验方法的研究进展

随着抗菌药物的广泛使用，耐药细菌正在出现，细菌的耐药性正在增加(Teuber等人，1999年)。耐药性细菌，尤其是多药耐药性细菌的日益增多，给人类和动物疾病的治疗带来了巨大困难(Walther等人，2008年)。细菌耐药性的出现和蔓延引起了全世界的关注，被世界卫生组织视为21世纪最大的公共卫生安全问题之一(Levy 2001)。因此，细菌耐药性的检测、监测和评价十分必要和迫切。
精细细菌耐药性的研究方法包括药物敏感性试验(迪波拿文都拉等人，2002；巴尔迪维索-加西亚等人，2009年)，质粒消除试验和质粒指纹技术(班尼特，2008年；钱德拉塞卡兰和拉里塔·库马里1998)，基因探针技术(阿彻和彭内尔1990；Ligozzi金属。1991年)，聚合酶链反应(Malhotra-Kumar等人，2005年；Strommenger等人，2003年)，逆转录聚合酶链反应技术(葡萄等人，2007年；Torres等人，2003年)，基因芯片技术(Frye等人，2006年；Perreten等人，2005)，其中细菌的药物敏感性试验是目前在各种实验室中确定细菌耐药性最常用的方法。确定抗菌药物在体外是否对微生物有抑制作用的方法称为药敏试验，简称药敏试验(Lingdaiwen 1999)。细菌药敏试验的常用方法可根据其效果分为测定药物最小抑制浓度(MIC)的肉汤稀释法和琼脂稀释法、测定含药纸抑菌圈直径的K-B(Kirby-Bauer)纸琼脂扩散法、结合稀释法和扩散法的E-test(Episilometer-test)。本文介绍了上述四种常用细菌药敏试验方法的原理和步骤，并分析了它们的优缺点。

1.3乳酸菌耐药性及耐药性水平基因转移

近年来，文献报道一些食品中使用的乳酸菌也出现了耐药性，并有增加的趋势，甚至在一些耐药菌株中检测到了耐药基因(D \'Aimmo等人，2007；少数抗性基因位于染色体上，而更多的抗性基因位于可移动的非染色体遗传因子上。细菌常见的移动遗传因子包括转座子、质粒、噬菌体和整合子基因盒系统等。这些可移动元件使乳酸菌基因可变，从而导致乳酸菌耐药性的广泛传播(徐海华等，2010)。Liu等人，2009年).
乳酸菌耐药性包括固有耐药性和获得性耐药性。固有耐药性是指细菌对抗生素固有的不敏感性，这是细胞固有的、稳定的遗传特征。抗药性基因通常位于染色体上。获得性耐药(Acquired drug resistance)是指细菌在抗菌药物的选择性压力下，通过基因突变和潜在基因表达，或者通过质粒或转座子等水平基因转移方法获得和表达外源性耐药基因的耐药特征(Tenover 2006)。质粒是细菌细胞中的一种自我复制的环状双链脱氧核糖核酸分子，可以在染色体外稳定地独立存在。质粒通常不整合到宿主染色体中。耐药质粒可以通过转化、接合、转导等方式在细菌之间转移。转化是指含有抗药性基因的细菌的溶解和它们自己的脱氧核糖核酸的释放。当含有耐药基因的脱氧核糖核酸进入敏感细菌时，耐药基因与敏感细菌的基因结合，敏感细菌转化为耐药细菌。接合是指耐药菌与敏感菌接触后，耐药菌将其耐药基因转移给敏感菌，使敏感菌具有耐药性。细菌可以通过接合一次转移对一种或多种抗生素的耐药性。革兰氏阴性菌，尤其是肠道细菌的间接重组更为常见。转导是指通过噬菌体将耐药基因转移给受体细菌。然而，由于噬菌体的特异性和噬菌体能够传递的少量脱氧核糖核酸，转导只能发生在同一细菌中，并且只能传递一种抗生素的耐药性(杨霞等人，2007)。
转座子(Tn)是一个比质粒小的脱氧核糖核酸片段。它可以在染色体中跳跃和移动，或者在同一细胞的染色体和质粒之间移动。通常通过复制将其插入新的位点，或者将其自身从原始位点切下并插入新的位点，从而大大增加结构基因的产物，从而使宿主细胞失去对抗菌药物的敏感性(夏永祥和陈杰，2010)。Tn还可以将位于染色体和非结合质粒上的基因转移到结合质粒中，从而实现细菌之间的转移或交换。转座子可以在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间转移，这是传播耐药基因的重要途径。

第二章乳酸菌的分离与鉴定...............................................15
2.1材料和方法......................................................15
2.2结果和分析.........................................................................19
2.3讨论....................................................................................23
第三章乳酸菌的药敏分析....................................................................25
3.1材料和方法....................................................................................25
3.2结果和分析...............................................................................................29
3.3讨论....................................................................................33
第四章抗性基因的检测....................................................................................35
4.1材料和方法.................................................................................35
4.2结果和分析.................................................................................38
4.3...................................................................................................39 4.4........................................................................................39
第五章乳酸菌的RAPD分型....................................................................40
5.1材料和方法.......................................................................40
5.2结果和分析.......................................................................41
5.3讨论....................................................................43
5.4概述....................................................................................44
第六章结论和展望........................................................45[/溴/]6.1结论................................................................................45
6.2前景..............................45
参考......................................................47

第六章结论和展望

6.1结论

(1)通过细菌培养、生化鉴定和16S rDNA鉴定，从不同地区酸奶中分离出18株保加利亚乳杆菌和25株嗜热链球菌。
(2)用琼脂稀释法测定了43株乳酸菌对11种抗生素的敏感性。通过将确定的最小抑制浓度与耐药性断点进行比较，确定每种菌株的敏感性或耐药性。药敏试验结果表明，43株受试菌株对11种抗生素呈现不同程度的耐药性，多重耐药现象较为严重。
(3)采用聚合酶链反应扩增技术检测抗生素耐药菌株中常见的耐药基因。检测结果表明，28株四环素耐药菌株中，共有3株含有四环素耐药基因tet(M)，检出率为10.7%。共检测出4株链霉素抗性菌株，32株中均含有链霉素抗性基因ant(6)，检出率为12.5%。在所有43株卡那霉素抗性菌株中，检测到7株含有卡那霉素抗性基因aph(3’)-IIIa，检测率为16.3%。(4)通过优化脱氧核糖核酸、Mg2+、引物及其浓度、模板脱氧核糖核酸浓度等因素，建立了RAPD分型技术的最佳反应条件:(25μLPCR反应体系)Mg2+浓度:2mM；DNTP浓度:200 μm；引物(CRA23)浓度:2微米；taqenzyme:1.25 U；；模板脱氧核糖核酸:50-100纳克。在此条件下，引物CRA23具有很强的鉴别能力，RAPD能够快速稳定地分析分离物的多样性。分型结果表明，43株受试菌具有较高的遗传多样性。

6.2展望

近几十年来，由于抗生素在临床上的广泛应用，病原菌的耐药性逐渐增加，给疾病的防治带来了很大的困难。近年来，病原菌的耐药性得到了广泛的研究，耐药机制和耐药基因的转移也有了广泛的报道。然而，研究发现，食品中使用的乳酸菌也产生了耐药性，并有增加的趋势，甚至在一些耐药菌株中检测到了耐药基因。乳酸菌的耐药性包括固有耐药性和获得性耐药性。固有耐药性是指细菌对抗生素天生不敏感，是细胞固有的稳定遗传特征。获得性耐药性(Acquired drug resistance)是指获得外源抗性基因并在抗菌药物的选择性压力下通过基因突变和潜在基因表达来表达它们的细菌，或者获得外源抗性基因并通过转化、转导或接合等水平基因转移方法表达它们的细菌，从而表现出耐药性特征。乳酸菌可能成为或已经成为抗性基因的受体或作为供体将抗性基因转移给其他细菌的试剂。酸奶作为一种日常乳制品，因其良好的口感和乳酸菌的益生菌功能而广受欢迎。因此，在人体胃肠道中，食用乳酸菌可能通过自身基因的突变和外源耐药基因的捕获产生耐药性，也可能通过质粒、转座子和整合子将耐药基因转移到肠道或环境中与其共存的其他病原菌，从而使病原菌获得耐药性或导致病原菌耐药性增加，从而给疾病的治疗带来困难。对食品中乳酸菌耐药性及耐药水平转移的研究，可以为提高乳酸菌耐药性，保护人体健康提供理论依据和正确指导。作者认为，进一步的研究应集中在耐药基因能否转移到肠道致病菌以及转移的方式和机制上。