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35900字硕士毕业论文用转基因小鼠分析Atoh1/Math1基因指导前房毛细胞再生。

论文类型:硕士毕业论文
论文字数:35900字
论点:毛细,小鼠,前庭
论文概述:

在含有pTM基因的小鼠体内,外源性的Atohl/Mathl基因位于四环素作用原件TRE下游。在正常情况下,外源性的Atohl/Mathl基因不表达,直到TRE与rtTA和强力霉素结合后,才可以启动Atohl/Mathl基因的表达。

论文正文:

前言

前庭毛细胞损伤引起的平衡功能障碍是临床上常见且多发的疾病。前庭毛细胞损伤有多种致病因素,最常见的原因包括使用氨基糖苷类抗生素等耳毒性药物和梅尼埃病等各种内耳疾病。目前前庭功能障碍的治疗措施主要是康复锻炼和对症治疗等保守措施。临床医生经常使用各种药物来缓解不适症状,如前庭功能障碍引起的弦晕和呕吐。然而,通过这种治疗措施很难从根本上治愈由毛细胞损伤引起的前庭功能障碍。相关基础研究表明,哺乳动物毛细胞损伤后可以部分再生,但再生毛细胞的数量非常有限,很难实现前庭功能的根本改善[1-3]。基因治疗是一种潜在的治疗方法,具有广阔的发展前景,可以有效促进毛细胞再生。颞骨的病理学研究表明,即使在严重损伤的情况下,大量的支持细胞和一些毛细胞仍保留在人内耳的感觉上皮中
材料方法
在含有pTM基因的小鼠中,外源性阿托耳/马塔尔基因位于四环素作用元件TRE的下游。正常情况下,外源Atohl/Mathl基因不表达,Atohl/Mathl基因的表达要等到TRE与rtTA和多西环素联合后才能开始。在含有rtTA基因的小鼠中,rtTA基因上游有一个可被Cre重组酶切割的终止框。当终止框被Cre重组酶切割时,rtTA基因开始表达。在含有FoxglCre基因的小鼠中,Cre重组酶仅在表达Foxgl基因的组织中表达(Foxgl在新生小鼠内耳的所有细胞中表达)。在本研究中,将具有三个基因的小鼠杂交,并选择具有三个基因的小鼠。该小鼠内耳上皮中的所有细胞都含有位于tre下游的rtTA和Atohl/Mathl基因,然后在不同的时间点给小鼠喂食含多西环素的食物和饮用水,理论上,外源Atohl/Mathl可以在特定时间内在内耳上皮细胞中表达。。因此,通过基因治疗恢复毛细胞数量,诱导受损前庭上皮中支持细胞转化为毛细胞是一种可行的方法。Atohl/Mathl基因是bHLH转录因子家族的成员,在各种动物组织的发育中起着重要作用。在哺乳动物中,阿托耳/马塔尔,作为一种无张力基因的同源基因,首次在[神经系统中被发现和表达。Atonal和Atohl/Mathl具有相似的编码序列和相似的功能。事实上,无调性音乐可以完全取代阿托尔/马塔尔在哺乳动物中扮演角色
结论。在哺乳动物的发育过程中,阿托尔/马塔尔可以诱导多种细胞,包括小脑小颗粒细胞、小脑菱形唇中间神经元、背侧连合中间神经元,许多特殊类型细胞的发育,如小肠杯状有意细胞、皮肤默克尔触敏细胞素和内耳毛细胞
在本研究中,使用了能够在多西环素诱导下有规律地定位和表达外源Atohl/Mathl基因的转基因小鼠模型。在这种小鼠模型中,FoxglCre基因使Cre重组酶只能在小鼠内耳组织中表达。在小鼠前庭上皮中,Cre重组酶可以去除rtTA基因上游的终止框,使rtTA基因表达。如果在特定时间点同时给小鼠喂食含多西环素的食物,rtTA和多西环素结合作用于外源阿托耳/马塔尔基因上游的四环素反应元件TRE,以启动外源阿托耳/马塔尔基因的表达。在本研究中,小鼠在出生后的不同时间点被喂食含有多西环素的食物和饮用水,以诱导Aothl/Mathl基因在小鼠中的表达。观察Atohl/Mathl基因在不同时间点对小鼠卵圆囊发育的影响,以确定是否产生新的毛细胞。然后,在使用多西环素诱导大量Atohl/Mathl表达的同时,将Brdu皮下注射到小鼠体内,并进行Brdu染色以观察Atohl/Mathl介导的前庭毛细胞再生过程中是否存在细胞分裂和增殖。最后,通过体外培养技术和诺奇、FGF、骨形态发生蛋白等信号通路的药物抑制,本实验研究了不同信号通路的抑制是否能诱导新毛细胞的产生。本研究的主要结论如下:
1。含有pTMl、foxglcre和rtTA基因的小鼠可以表达外源性Atohl/Mathl
2。外源性Atohl/Mathl在动物体内的表达可在多西环素诱导后,在本研究涉及的所有时间点诱导新前庭毛细胞的产生。新生前庭毛细胞主要分布在微槽区、微槽区附近和感觉上皮中的非感觉上皮。新生毛细胞可被Myo7a标记,并具有小纤毛群
3。前庭上皮产生新生毛细胞的能力随着出生后时间的延长而逐渐降低。到出生后第7天,新的毛细胞不能在非感觉区域被诱导。直到出生后第21天,在
4感觉上皮的微槽区和微槽e附近都不能诱导新的毛细胞。外源性Atohl/Mathl在新生阳性小鼠前庭感觉上皮过度表达可诱导显著的细胞增殖,尤其是在微槽区和微槽区附近
5。一些新生前庭毛细胞在有丝分裂后与子细胞分化,提示Atohl/Mathl诱导新毛细胞的产生可能有两种机制,一种是首先促进细胞分裂,另一种是首先促进细胞分裂。另一种是从支持细胞直接分化为毛细胞
6。Notch和FGF信号通路的抑制可增强前庭感觉上皮细胞Atohl/Mathl的表达,并诱导微槽和近微槽区新毛细胞的产生。。虽然在相关研究中普遍认为Atohl/Mathl在促进许多特殊类型细胞的终末分化中起重要作用,但也有证据表明Atohl/Mathl可以在特定的前体细胞群
参考
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以前的研究表明,阿托耳/马塔尔在动物组织发育中的作用似乎分为两个不同的阶段。在国美复眼的发育过程中,无调性首先在整个前神经场中的所有细胞中表达,然后在缺口信号通路介导的侧向抑制下在一些细胞中特异性表达,并促进这些细胞分化为特殊类型的光感受器[12,13]。类似地,在损伤后鸡内耳上皮的再生过程中,Atohl/Mathl首先在整个上皮的所有细胞中广泛表达,然后定位于部分细胞并分化为毛细胞[14]。斑马鱼Atohl/Mathl有两个同源基因atohla和atohlb。这两个基因功能相似,可以确定前神经区域,促进感觉细胞的发育。然而,阿托hla专注于确定前神经区域,而阿托HLA主要促进感觉细胞的发育[15]。在小鼠内耳发育过程中,Atohl/Mathl的作用似乎仅限于促进毛细胞发育。虽然可以在前体结构域[16,17形成之前检测到编码阿托耳/马塔尔的mRNA,但是阿托耳/马塔尔蛋白仅存在于有丝分裂后分化为毛细胞的前体细胞中[18]。此外,基因敲除实验表明,阿托耳/马塔尔对前感觉区的形成和前体细胞从有丝分裂中退出没有关键的调节作用[16,18,19]。
除了转录因子Atohl/Mathl之外,Notch信号通路、FGF信号通路和骨形态发生蛋白信号通路也已知对内耳毛细胞的发育具有重要的调节作用。Notch通路在内耳感觉上皮早期发育中决定前感觉区的过程中起着重要作用。胚胎早期发育中对Notch信号通路的干扰可导致毛细胞的增加和支持细胞的减少[20-22]。出生和成年后不久从小鼠卵圆囊的接受上皮中去除毛细胞,或者用抗毒素抑制Notch信号通路,可以上调Atohl/Mathl的表达水平,并将一些支持细胞转化为毛细胞[23,24]。目前,对FGF和骨形态发生蛋白信号通路的研究主要集中在耳壶中的科尔蒂器官。FGF8在耳盘科尔蒂器官中的表达和毛细胞形成的早期阶段通过与其受体Fgfr3 [22,25-28的相互作用来调节内部手指细胞的发育。FGF信号通路的激活可导致转录因子Hey2的表达增加,这可防止手指细胞在耳壶发育过程中转化为毛细胞。骨形态发生蛋白4在耳盘中科尔蒂器官外侧的小上皮嵴中表达,其功能可能与限制科尔蒂器官中毛细胞和支持细胞的数量有关,[27,28,29]。

前言:转基因小鼠的育种和基因分型

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第二章阿托h1/Math1介导的前庭毛细胞再生……39-48
材料方法……39-41
结果……41-42
附图……42-45
讨论……45-47
参考……47-48
第三章前庭毛细胞不同信号通路的调节……48-56
材料和方法……48-50
结果……50-51
附图……51-53
……53-55
参考资料……55-56

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