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37628字硕士毕业论文Sirtl对内脏脂肪细胞定向分化的影响及其机制

论文类型:硕士毕业论文
论文字数:37628字
论点:脂肪,内脏,肥胖
论文概述:

本文是药学论文,主要论述脂质代谢及脂肪分化异常导致体内脂质过度沉积所引起的肥胖已日益成为突出的全球性健康问题。与皮下脂肪库累积导致的外周型肥胖相比,内脏脂肪过度沉积与糖尿

论文正文:

1前言

肥胖是因脂质代谢及脂肪分化异常,导致体内脂质过度沉积所引起的一种代谢性疾病,随着生活水平的提高及生活方式的转变,肥胖己日益成为突出的全球性健康问题⑴。近40年间,美国肥胖人群由13%升至30%左右;而我国成年人群中,约2亿人超重,其中肥胖症患者达6000多万。根据脂肪沉积部位的不同,可分为内脏型肥胖和外周型肥胖:内脏型肥胖表现为大网膜、肾周等内脏脂肪库中脂肪过量沉积,而外周性肥胖则表现为脂肪在臀部及大腿等皮下脂肪库中大量累积。大量研究证实,肥胖不仅与糖尿病、多囊卵巢综合征等代谢性疾病密切相关,而且也是高血压、冠心病等心血管疾病以及结肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤发病的高危因素;并且,近年来的研究显示,与外周型肥胖比较,内脏脂肪的过量积聚与代谢、心血管疾病的发生发展关系更为密切,其机制并不十分清楚,可能与内脏及皮下脂肪生物学特性存在差异有关。因此,深入揭示内脏脂肪分化与功能的调控机制,寻求内脏型肥胖防治的新祀点日益成为肥胖研究领域的热点问题。
基于白色脂肪库中脂肪细胞分化及脂质代谢异常是引起肥胖最直接的原因,长期以来,众多学者以白色脂肪为对象,进行了大量的研究。近年来研究显示,在成人体内,还存在以产热耗能为主的产热型脂肪(棕色/米色脂肪)。这种产热型脂肪高表达线粒体解偶联蛋白UCP1,可通过诱导解偶联呼吸显著抑制能量储存,使摄入的能量主要以热能的形式消散,发挥产热的效应从而对抗肥胖及其相关性疾病。资料表明,棕色脂肪与白色脂肪具有不同的起源:棕色脂肪起源于Myf5阳性的前体细胞(骨豁肌/棕色脂肪细胞前体),这些前体细胞在不同诱导条件下可分别向骨豁肌或者掠色脂肪分化;而白色脂肪则主要由白色脂肪库中Myf5阴性的前体细胞分化而来。有趣的是,白色脂肪库中存在的一些Myf5阴性细胞虽然UCPl的基础表达水平较低,但在特定的诱导条件下,例如冷刺激、cAMP处理后,UCP1的蛋白表达水平可迅速升高至经典的棕色脂肪水平,产热效应显著增加。由于这些诱导产生的“棕色脂肪”在形态与功能上介于白色与棕色脂肪之间,因此又被称为“米色脂肪”;进一步的研究发现,米色脂肪拥有特异性的分子标记TMEM26和CD137[i2]。由于产热脂肪具有显著的燃烧脂肪、抑制脂肪沉积作用,因此关于产热脂肪形成的调控机制近年来迅速引起众多学者的关注。
PR结构域蛋白16 (PR domain-containing 16,PRDM16)基因是在研究人类白血病发病机制的过程中发现的,定位于1号染色体(lp36.3)。PRDM16编码1257个氨基酸。除了 DNA结合锌指结构域、脯氨酸结构域、阻遏物结构域外,在N端83-215氣基酸处含有与SET结构域高度同源的PR结构域。近年来的资料表明,PRDM16基因是棕色/米色脂肪分化的决定性基因,也是产热程序启动的\"开关基因”,可以诱导多种前体细胞向棕色/米色脂肪分化,发挥产热耗能的作用。PRDM16基因经选择性剪切后可产生两种主要的异构体,全长PRDM16与PR结构域缺失的SPRDM16;研究发现,在急性髓性白血病的发病过程中,两种异构体功能存在差异,在p53表达缺失的情况下,SPRDM16过表达可诱导白血病的发生,而PRDM16在其中的作用则具有明显的组织选择性,然迄今为止,两种异构体在棕色/米色脂肪形成中的作用是否存在差异并不清楚。
Sirtuin-l(Sirtl)基因是一种NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶SIR2家族成员,能够促进组蛋白去乙酰化,在细胞能量代谢和氧化还原中发挥重要作用。研究表明,Sirtl具有抑制肥胖,降低血糖的作用,其机制十分复杂,涉及对能量代谢中枢及外周脂肪组织等紀器官的调控。即往研究主要集中在Sirtl对以储能为主的白色脂肪分化成熟及能量代谢的调控方面,研究发现Sirtl可抑制白色脂肪前体向白色脂肪分化,从而抑制白色脂肪组织中脂质积聚,减轻体重。最新的资料表明,Sirtl可通过促进过氧化物酶体增殖激活受体PPAR-Y去乙醜化,进而招募PRDM16引起皮下白色脂肪的“掠色/米色化”,从而启动皮下白色脂肪的产热程序,解偶联呼吸增加,促进能量消耗及产热[20]。有趣的是,尽管Sirtl过表达可通过促进PPAR-Y去乙酷化招募PRDM16,诱导小鼠皮下白色脂肪“米色化”,但其内脏脂肪中并没有出现明显的米色脂肪,提示Sirtl对内脏与皮下脂肪的分化调控亦存在差别[2*^但Sirtl对内脏脂肪前体细胞定向分化到底发挥何种作用目前亦未阐明。
白黎戶醇是已知最强的天然Sirtl激动剂,但由于化学性质不稳定,生物利用度差,且常出现“脱紀效应\",从而限制了其在临床应用[21]。(E)-3,5,4’-三甲氧基-1, 2-二苯乙稀-间-3,5,4’-白黎戶醇,BTM-0512是合成的白藜戸醇甲基化衍生物,具有显著的Sirtl激动作用,临床前药代动力学研究发现其稳定性及脂溶性显著提高,生物利用度增加[22];我们课题组及其他学者研究发现,BTM-0512在内皮细胞衰老、胃淸病及肿瘤等方面具有广泛的生物学作用,但其在肥胖中的作用未见报道。
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2材料与方法

2.1试剂与仪器
2.1.1主要试剂
Tween-20 (吐温-20)                                   Amresco 公司,美国
Glycin (甘氨酸)                                          Amresco公司,美国
TEMED (四甲基乙二胺)                             Amresco公司,美国
SDS (十二烧基硫酸钠)                             Amresco公司,美国
APS (过硫酸钱)                                           Amresco公司,美国
Acrylamide (丙炼酰胺〉                                Amresco公司,美国
N,N’-亚甲基双丙稀醜胺                              Amresco公司,美国
TrisC三经甲基氨基甲烧)                            Sigma公司,美国
PVDF膜(聚偏二氟乙稀膜)                       MUlpore公司,美国
Trizol RNA提取试剂                                      TAKARA公司,日本
RrimeScript逆转录试剂盒                           TAKARA公司,日本
SYBR Real-time试剂盒                               TAKARA公司,日本
PRDM16兔源多克隆一抗                            Abeam公司,美国
Sirtl兔源多克隆一抗                                      Abeam公司,美国
彩色预染蛋白 Maker                                    碧云天生物技术研究所,江苏
CD34小鼠源单克隆一抗                             Abeam公司,美国
CD44小鼠源单克隆一抗                             Abeam公司,美国
HLA-DR小鼠源单克隆一抗                        Abeam公司,美国
兔抗鼠FITC                                                  Abeam公司,美国
Western及IP细胞裂解液                           碧云天生物技术研究所,江苏
BCA蛋白浓度测定试剂盒                          碧云天生物技术研究所,江苏
PMSF (苯甲基横酷氟)                             碧云天生物技术研究所,江苏
5XSDS-蛋白上样缓冲液                           碧云天生物技术研究所,江苏
Westem-blot 一抗稀释液                         碧云天生物技术研究所,江苏
Westem-blot 二抗稀释液                          碧云天生物技术研究所,江苏
人PRDM16引物                                           生工技术服务有限公司,上海
人Sirtl引物                                                     生工技术服务有限公司,上海
人UCP1引物                                              生工技术服务有限公司,上海
人C/EBPP引物                                           生工技术服务有限公司,上海
人Resistin引物                                            生工技术服务有限公司,上海
小鼠PRDM16引物                                       生工技术服务有限公司,上海
小鼠Sirtl引物                                                   生工技术服务有限公司,上海
小鼠UCP1引物                                             生工技术服务有限公司,上海
小鼠C/EBPP引物                                         生工技术服务有限公司,上海
小鼠Resistin引物                                           生工技术服务有限公司,上海
小鼠TMEM16引物                                         生工技术服务有限公司,上海
PBS磷酸盐缓冲液                                     中杉金乔生物技术有限公司,北京
DMEM高糖培基                                           Hyclone公司,美国
胎牛血清                                                       Hydone公司,美国
I型胶原酶                                                       Gibco公司,美国
胰酶                                                                 Sigma公司,美国
猪胆盐                                                             聚源生物有限公司,上海
胆固醇                                                             鼎国生物有限公司,北京
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)                  Sigma公司,美国
地塞米松                                                         Sigma公司,美国
胰岛素                                                              Sigma公司,美国
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2.2方法
2.2.1人内脏脂肪组织的收集
收集腹部手术患者内脏脂肪,取手术样本前病人知情同意,由中南大学湘雅三医院提供。入选及排除标准如下-以体重指数(BMI=体重kg/身高m2) >25,作为超重/肥胖组;以体重指数在18.5-24.9之间为对照组;排除下丘脑、垂体疾病等引起的继发性肥胖;排除高脂血症、高血压、冠心病、心肌梗塞、脑血管意外、糖尿病、脂肪肝、多囊卵巢综合症、子宫内膜癌、骨关节炎、睡眠性呼吸暂停综合征、精神疾病、肥胖相关性肾病、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌等肥胖相关性疾病。
2.2.2人内脏脂肪SVF实验
2.2.2.1人内脏脂肪SVF分离、培养
根据上述入选及排除标准,选取对照组患者内脏脂肪组织,手术取材2小时内进行细胞培养,冰盒保存运输。
①取人内脏脂肪组织,剪成约Icm3大小;
②用PBS (0.01M, 4°C保存)洗漆2次,每次1分钟;
③用眼科剪将结缔组织剪除;
④剪碎脂肪组织,约Irrnn3大小;
⑤加入ImLI型胶原酶(PBS配制浓度为0.01M, -20°C保存),37°C恒温水浴锅45 rpm震荡消化120分钟;
⑥收集消化液,2000 rpm离心10分钟;
⑦弃上清,加入细胞培养液(高糖DMEM培基含10%胎牛血清、1%双抗)吹打细胞沉淀,200目细胞蹄过滤;
⑧重悬细胞,种入6孔板,于37\'C、体积分数为5%的C02饱和湿度条件下培养24小时;
⑨换培养基,洗去未贴壁细胞;
⑩细胞长至90%融合后用胰酶(0.25%,ImL) 37°C消化5分钟传代处理,至第三代。
2.2.2.2人内脏脂肪SVF流式细胞仪鉴定
取第3代SVF,吸去培养基,0.25%胰酶常规消化,制成1>