单基因遗传病分子诊断技术的发展研究,哪些现代分子生物学技术可以用于遗传病诊断?原则...
单基因遗传病分子诊断技术的发展研究
哪些现代分子生物学技术可以用于遗传病诊断?原则...可用于遗传病诊断的现代分子生物学技术大致可分为三类。一种是细胞水平的遗传病诊断,主要包括组织、细胞学和染色体分析。例如,遗传性球形红细胞增多症是一种显性遗传疾病。通过对患者的细胞学检查,可以发现红细胞较小,中心色度较暗,红色较薄。
单基因遗传病的分子诊断策略有哪些
核酸分子杂交技术可以早期诊断单基因遗传病。 镰状细胞性贫血是地中海地区发病率高的单基因遗传病。已知正常红细胞的基因型是bb和Bb,镰状细胞贫血患者的基因型是BB。 一对夫妇被测试为致病基因的携带者。为了分娩,
哪些现代分子生物学技术可以用于遗传病诊断?原则...
哪些现代分子生物学技术可以用于遗传病诊断?原则...可用于遗传病诊断的现代分子生物学技术大致可分为三类。一种是细胞水平的遗传病诊断,主要包括组织、细胞学和染色体分析。例如,遗传性球形红细胞增多症是一种显性遗传疾病。通过对患者的细胞学检查,可以发现红细胞较小,中心色度较暗,红色较薄。
单基因遗传病的分子诊断策略有哪些
单基因遗传病分子诊断技术的发展研究范文
关于遗传疾病的第三篇论文
主题:单基因遗传病分子诊断技术的发展研究
摘要:单基因疾病是指由一个或一对等位基因突变引起的疾病,一般遵循孟德尔遗传规律。传统的单基因疾病诊断通常依赖于系谱分析、生物化学、影像学等手段。近年来,分子诊断技术,特别是高通量测序技术,已经成为单基因疾病的主要诊断方法,在单基因疾病的明确诊断、预防和治疗指导方面发挥着越来越重要的作用。本文综述了40年来单基因疾病分子诊断技术的发展,介绍了其最新进展,并展望了其在单基因疾病中的未来研究进展。
关键词:单基因遗传病;分子诊断;高通量测序;
高通量测序下单基因疾病遗传诊断的研究进展
蔡鳌雪文淑孔向东
郑州大学第一附属医院产前诊断中心
摘要:
单基因疾病是指由单个基因或单个等位基因突变引起的疾病,可以很容易地用孟德尔遗传来解释。单基因疾病的传统遗传诊断通常依赖于系谱分析、生化、影像学等。近年来,分子诊断技术,特别是高通量测序技术,已经成为单基因疾病的主要诊断工具。这些分子技术在单基因疾病的诊断、预防和治疗中发挥着越来越重要的作用。本文综述了40年来单基因疾病分子诊断技术的发展,并介绍了其最新进展和对未来研究的展望。
关键词:
单基因疾病;分子诊断学;高通量测序;
单基因疾病是指由单个或单对等位基因突变引起的疾病,通常遵循孟德尔遗传规律。目前,人类已知的单基因疾病有1万多种。虽然单一疾病的发病率很低,但通常被称为罕见疾病,但由于其种类繁多,它在[1]人口中的总发病率仍约为1/100,因此罕见疾病并不罕见。长期以来,由于技术限制,单基因疾病既不能预防也不能治疗。随着分子生物学技术的发展,越来越多的单基因疾病可以被预防,有些甚至可以被治疗,甚至基因治疗。基因诊断或分子诊断已经成为预防和治疗单基因遗传病的主要前提手段之一。
分子诊断是当代医学发展的重要前沿领域之一,其核心技术是基因诊断。最早的分子诊断技术是[南部在1975年发明的脱氧核糖核酸印迹技术。1976年,美籍华裔科学家岳伟勤成功应用液相脱氧核糖核酸分子杂交技术实现镰状细胞性贫血的基因诊断[3],这是人类遗传病诊断进入分子诊断时代的一个重要里程碑。随着高通量测序技术的发展,单基因遗传病的临床分子诊断技术发展迅速。本文综述了传统单基因遗传病遗传诊断方法和以高通量测序为代表的分子诊断方法的研究进展,以期为临床遗传病诊断提供一些有益的参考。
1分子诊断在单基因遗传病中的应用
目前,分子诊断在单基因遗传病临床工作中的主要应用包括六个方面:(1)通过分子诊断进行单基因疾病的临床诊断、鉴定或鉴定已经成为一项常规临床工作,最常见的有儿科内科、神经病学、内分泌学、肾脏学等。分子诊断在一定程度上可以替代常规诊断,例如,脊髓型肌营养不良症(SMA)和杜兴型肌营养不良症(DMD)的基因诊断已经成为一线诊断。(2)症状前基因诊断。如果发现一些遗传代谢疾病或迟发性遗传疾病并及早治疗,避免疾病和残疾是非常重要的。例如,肝豆状核变性(HLD)家族如果能及早发现患者并及时进行除铜治疗,可以避免疾病的发生,早期诊断可以通过分子诊断实现,有助于治疗。(3)新生儿遗传代谢疾病筛查,大多数新生儿疾病为单基因遗传病,但这些严重遗传病的表型大多相似,难以用常规方法识别或鉴定。通过对新生儿遗传代谢疾病或先天性免疫缺陷病的分子诊断,可以及时诊断出遗传病,医生和家庭成员可以少走弯路,为下次妊娠提供科学咨询。(4)产前诊断,通过孕早期和中期胎儿绒毛和羊水的分子诊断,可以确定胎儿是否患有遗传病。(5)胚胎植入前的基因诊断。孕妇胚胎植入前,患有单基因遗传病的家庭对胚胎进行分子诊断,选择健康胚胎进行植入,可以避免在妊娠中期(如确诊妊娠)进行产前诊断所带来的治疗性流产的痛苦选择。(6)孕前或群体单基因遗传病筛查,隐性遗传病有突然和隐性分娩的风险。对两对隐性遗传病携带者进行孕前筛查,可以防止隐性遗传病夫妇生育隐性遗传病子女。
2单基因遗传病的常规分子诊断技术
2.1南部印迹
南方在1975年发明了基因印记技术。Southern印迹(Southern blot)是最经典的脱氧核糖核酸分子检测方法,已被广泛用于检测各种基因突变,包括缺失、插入、易位等。由于步骤复杂、电离辐射等缺点,它已逐渐退出主流检测领域。然而,它对臂肌营养不良症的基因诊断不能取代[4]。此外,近年来,很少有其他单基因遗传病的报道通过Southern印迹技术进行诊断。
2.2聚合酶链反应
聚合酶链反应技术是由塞特斯聚乙烯公司的凯利·穆利斯(Kary Mullis)于1985年在[5]建立的,已成为核酸分子扩增检测中最常用的方法。在单基因遗传病的分子诊断中,一些基因突变如大片段缺失可以通过聚合酶链反应技术直接检测出来。例如,DMD基因大片段缺失的男性患者可通过聚合酶链反应直接扩增,然后可通过琼脂糖电泳检测技术[6]进行DMD的分子诊断。目前,聚合酶链反应技术主要用作常规基因诊断的基本步骤,如多重连接依赖探针扩增(MLPA)、桑格测序、芯片杂交等基本步骤。因此,聚合酶链反应是许多分子诊断技术的基本方法,是目前分子诊断实验室的主流技术之一。
2.3多重连接探针扩增技术(MLPA)
斯豪滕等人于2002年首次报道了MLPA技术。这是一种能够检测同一反应管中多达50个核苷酸序列拷贝数变化的方法。它具有特异性高、准确度高、重复性好、操作简单、高通量等优点。MLPA技术可以检测几个人类基因拷贝数的变化,以及已知的点突变。它已被广泛用于具有基因缺失/重复突变和点突变的人类遗传疾病的分子诊断,例如糖尿病/骨密度、形状记忆合金和迪乔治综合征[8,9,10]。然而,MLPA需要高浓度和高纯度的脱氧核糖核酸。它只能检测基因或染色体数目异常或已知点突变,而不能筛查未知点突变和平衡易位。此外,MLPA技术的发展必须需要毛细管电泳设备。
2.4聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(聚合酶链反应-RFLP)
聚合酶链反应-RFLP技术主要针对聚合酶链反应产物,选择特定的限制性内切酶进行酶消化,然后利用琼脂糖电泳或聚丙烯凝胶电泳技术分离酶片段。目前主要用于带有突变热点的基因检测,如外显子7缺失检测、SMA致病基因SMN基因突变热点检测、FGFR3基因突变热点cll38A>G位点突变检测等。[11,12]。
2.5三引物pcr
聚合酶链反应是一种聚合酶链反应扩增方法,使用一对引物和一个随机组合的中间引物,共有3个引物。该方法常用于检测动态突变遗传病中的三核苷酸拷贝数变异。用毛细管电泳检测聚合酶链反应产物,形成连续的毛刺峰,其范围超过一定数量的碱基(如50 CTG×3),表明它们是患者。聚合酶链反应需要设计合理的中间引物,应注意保证引物的浓度比和使用高特异性的脱氧核糖核酸聚合酶。目前,脆性x染色体综合征的致病基因FMR1基因和强直性肌营养不良的致病基因DM1基因的动态突变检测在临床上被广泛应用于[13,14]。
2.6巢式聚合酶链反应扩增技术
反转录聚合酶链反应是指扩增长度大于5 kb片段的聚合酶链反应。LR-PCR需要高保真度的脱氧核糖核酸聚合酶,它不仅具有高保真度,而且具有优异的延伸性和高扩增效率。巢式聚合酶链反应(巢式聚合酶链反应)使用以前聚合酶链反应的产物作为模板,设计引物来扩增多个或单个小的聚合酶链反应片段。对于具有高度同源序列的基因(如PKD1、GBA、SMN1、CYP21A2基因)的序列突变分析,为了避免同源序列(假基因)的干扰,通常使用基于LR-聚合酶链反应的巢式聚合酶链反应扩增技术。首先,比较目标基因和同源序列,找出差异位点,设计长片段特异性引物,保证LR-PCR扩增的特异性。其次,以LR-聚合酶链反应产物为模板和内部巢式聚合酶链反应引物,通过常规聚合酶链反应扩增目标基因的特定靶区。
2.7反向聚合酶链反应
ⅰ-聚合酶链反应是一种甲型血友病的检测技术,甲型血友病是一种由F8基因突变引起的连锁隐性遗传病。F8基因的Inv22和Inv1分别占重质腐植酸的40%~50%和2% ~ 3%。Inv22和Inv1的检测方法包括Southern印迹聚合酶链反应(长距离聚合酶链反应,LD-聚合酶链反应)和ⅰ-聚合酶链反应。目前,检测内含子22重组常用的方法有二种。片段长度大于10 kb,内含子22重组的亚型无法确定。此外,扩增片段气相色谱含量高,对核酸质量和试剂要求高,成功率低。ⅰ-聚合酶链反应包括三个步骤:酶消化、环化和引物扩增。ⅰ-聚合酶链反应(I-PCR)具有产物片段大小特异、片段大小小、气相色谱含量低的优点,可以快速检测inv 22-ⅰ、Dup22和Del22的患者、携带者和正常人。
2.8脱氧核糖核酸芯片技术
脱氧核糖核酸芯片(DNA chip)的原理是在固定的支持物上合成大量寡核苷酸作为脱氧核糖核酸探针,与待检测的核酸片段杂交,并分析杂交信息,获得基因序列和靶片段表达等信息。该技术检测信息吞吐量高,自动化程度高。它可以同时检测许多突变位点,可用于疾病的早期临床诊断和批量筛选、基因表达谱测定、多态性分析等。然而,由于芯片技术只能检测已知的突变位点,随着高通量测序技术的快速发展,基因芯片在单基因遗传病基因诊断中的应用受到了一定程度的限制。在中国,基因芯片在单基因疾病诊断中的应用主要是耳聋基因芯片的检测。
3高通量以测序为中心的单基因疾病分子诊断策略
3.1小组目标排序
基于面板的靶向高通量测序可分为单基因靶向捕获高通量测序和多基因靶向捕获高通量测序。设计单基因靶向Panel高通量测序的理论基础是,检测DMD基因、结节性硬化症(TSC) tsc1/2基因等片段较长的基因的Panel检测效率远优于Sanger测序。另一种多基因靶向捕获面板高通量测序针对遗传异质性强的疾病,如癫痫、痉挛性截瘫、遗传性肌病、非综合征性遗传性耳聋等疾病。给定样品中多种致病基因的同时测序和分析具有快速、高效的特点,但也有一定的局限性。例如,随着新致病基因的不断发现,多基因靶向捕获高通量测序面板需要不断更新,但更新速度一般落后于新致病基因的发现速度,使得面板具有一定的滞后性。
3.2全外显子组测序
WES是一种利用杂交捕获技术获得并富集基因组中所有具有蛋白质编码功能的外显子区脱氧核糖核酸序列,并对后者进行高通量测序的分析方法。整个人类基因组中有多达180,000个外显子,约占整个基因组的1%,[6]。通过高通量测序技术进行外显子测序是发现或鉴定导致疾病的遗传变异的有效方法。
2009年,Ng等人[16]在世界上首次证实外显子测序在确定罕见致病基因方面具有可行性和应用价值,2010年[17]首次利用WES技术成功鉴定出米勒综合征(Miller syndrome)致病基因dhodh。整个外显子测序技术需要少量样品、高通量和低成本,极大地促进了人类单基因遗传病的分子诊断。
外显子测序可以更快地识别致病基因和突变位点[18],这有助于加快单基因疾病、癌症等复杂疾病的致病基因和易感基因的筛选和发现。然而,外显子测序只能捕获聚焦于外显子区域的测序,不能获得完整的基因组信息,不适合检测脱氧核糖核酸结构变异和高度同源的区域变异。
3.3全基因组测序,WGS)
WGS将用已知的标准基因组序列对个体的整个基因组进行重新测序。韦斯(外显子测序)不能有效检测外显子以外区域的基因,整个基因组可以通过WGS [18,19,20]检测。因为人类基因组太大,很难达到单端全基因组测序所需的测序深度,这需要重复测序或双端测序。因此,WGS是昂贵的,结果的准确性将会降低,因为它不能达到足够的测序深度,因此目前很难将其大规模应用于临床实践。
3.4单基因遗传病高通量测序的局限性
尽管高通量测序具有高通量和相对低成本的特点,但在单基因疾病的基因诊断方面仍有其局限性。首先,高通量测序的结果必须通过桑格测序来验证。通常,高通量测序的结果不能直接用于诊断。其次,高通量测序不能解决某些特殊单基因疾病的基因突变检测,包括血友病A基因的长片段倒位等基因倒位突变,SMA、肾上腺皮质发育不良、成人多囊肾等假基因疾病的基因诊断,高通量测序往往得不到满意的结果。第三,由于种族差异、数据库和基因突变功能验证的影响,大量高通量测序结果无法得到很好的解释,这也制约了高通量测序在单基因遗传病分子诊断中的应用。
4基于高通量测序的无创产前分子诊断(NIPD)
4.1胎儿游离核酸非侵袭性单基因疾病的产前诊断
胎儿单基因疾病非侵入性产前诊断的基本原则是检测胎儿是否携带母体血浆总游离脱氧核糖核酸(CF DNA)中来自父母的致病基因或致病基因突变。对于常染色体显性遗传疾病,通过检测孕妇血浆中的游离脱氧核糖核酸是否携带致病部位(父系突变和新突变)来判断胎儿是否患病。目前,软骨发育不全是[最广泛使用的方法。对于常染色体隐性遗传疾病,如果父母携带不同的杂合突变(先证者为复合杂合突变),如果在孕妇外周血中检测到父亲突变,则胎儿有50%的发病风险,应进一步进行侵入性产前诊断,以确定胎儿是否患病。如果没有检测到父亲的突变,胎儿最多是携带者。孕妇不需要侵入性产前诊断,从而避免50%的孕妇进行侵入性产前诊断,从而减少不良妊娠结局的发生[22]。如果父母携带相同的致病杂合子突变,有必要通过大规模平行测序或数字聚合酶链反应技术准确定量无胚胎细胞的胎儿脱氧核糖核酸(CFF脱氧核糖核酸)的浓度,从而区分该突变是来自父母来源还是来自母亲来源[23]。目前,可通过非侵入性产前检测诊断的单基因疾病包括软骨发育不全、先天性肾上腺增生(CAH)、糖尿病、枫糖浆尿病、β地中海贫血和形状记忆合金[21、24、25、26、27、28]。目前,最新进展是通过无创产前基因检测来解决新的突变。将来,NIPD可用于胎儿群体筛查,包括固有突变和新突变。
4.2循环胎儿细胞非侵袭性单基因疾病的产前诊断
早孕母体血液中含有微量胎儿有核红细胞,NRBC),由于其单核细胞多、胎儿遗传信息完整、细胞周期短,被认为是NIPD的理想靶点,更适合全基因组分析。然而,母体血液中的胎儿细胞很少,这限制了其应用的发展。目前,大多数临床研究旨在改进细胞分离方法。一些研究已经成功地使用基于红细胞微流体技术和负富集的两阶段富集方法来分离循环胎儿细胞并完成性别鉴定[29]。循环胎儿细胞在无创产前检测领域具有巨大潜力。相信随着技术的进一步发展,利用循环胎儿细胞治疗NIPD单基因疾病将成为一个新的研究热点。
4.3宫颈滋养细胞非侵袭性单基因疾病的产前诊断
在孕妇的宫颈粘液中,也有绒毛细胞从胎儿上脱落,其数量不受胎儿年龄、孕妇体重和孕妇年龄的影响[30】。这一发现为非侵袭性单基因疾病的诊断提供了新的思路。研究已经成功地使用从宫颈脱落细胞中分离的胎儿细胞来诊断地中海贫血和/或血红蛋白变异[31]。该技术具有良好的应用前景,但样本母细胞污染问题会导致较高的假阳性率,这是目前面临的主要挑战。
5总结和展望
分子诊断已深入应用于单基因遗传病诊断、产前诊断和新生儿筛查。将保留一些基于聚合酶链反应和南方杂交的经典分子诊断技术。然而,越来越先进和准确的分子诊断技术将会不断建立和发展,特别是随着高通量测序的快速发展,基于高通量测序的单基因遗传病分子诊断方法,包括第三代测序,将会得到更广泛的应用。此外,越来越先进的分子诊断技术的建立和发展也对相关研究者和临床医生的使用、解释和咨询提出了更高的要求。
参考
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