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93125字博士毕业论文欧美PRRSV和猪圆环病毒2型基因工程疫苗的结构和实验免疫研究。

论文类型:博士毕业论文
论文字数:93125字
论点:疫苗,病毒,免疫
论文概述:

本文是基因工程论文,本实验以美洲型 PRRSV CC 株的 ORF3、ORF5 基因,欧洲型代表株 LV株 ORF3、ORF5 基因及 PCV2 ORF2 基因为基础,构建了欧洲型 PRRSV 重组核酸苗(pVAX1-EU-ORF3-ORF5)、欧洲型 PRRSV 和

论文正文:

第一章欧美PRRSV ORF3、ORF5和PCV2 ORF2基因的克隆和序列分析。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在北美和欧洲同时爆发,并构成持续威胁,在包括中国在内的多个国家的养猪业造成重大经济问题。PRRSV属于动脉炎病毒科,动脉炎病毒属,是猪复杂呼吸道疾病的主要病原体。prrsv的发病特点是断奶仔猪生长缓慢、食欲不振、厌食、发热、咳嗽和呼吸困难。成年猪的特征是繁殖障碍。PRRSV通常分为两种基因型,欧洲和北美。这两种基因型在临床、抗原和遗传方面是不同的。尽管PRRSV的异质性是显而易见的,但尚不清楚这种异质性是如何在进化过程中形成的。此外,包括中国在内的世界许多地方已经证明了这两种基因型可以共存,并且这两种基因之间几乎没有交叉保护。此外,改性活疫苗病毒的重组现象和中国的局部变异使得加强疫苗应用或疾病的管理和控制策略更加困难。此外,如果在这个地理区域有其他并发疾病,如猪圈、伪狂犬病、猪瘟、猪流行性腹泻等。,我国蓝耳病的感染程度可能会增加。

猪圆环病毒是一种无包膜的单链环状脱氧核糖核酸病毒。它于1998年首次被隔离,并迅速传播到世界各地的养猪业。PCV-1和PCV-2有两种血清型。猪疾病的主要原因是猪圆环病毒2型。猪圆环病毒2型感染与猪圆环病毒病(PCVAD)密切相关,如猪肠道疾病、猪呼吸综合征(PRDC)、猪皮炎和肾病综合征(PNDS)、先天性仔猪震颤、生殖障碍、胎儿心肌炎和扩张性坏死性肺炎等。除了引起断奶后多系统衰弱综合征(PMWS),该疾病被世界各国公认为继猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)之后新发现的一种重要的猪传染病。

本研究以欧洲PRRSV低压株、美国PRRSV CC株和PCV2 NM株为基础,分析了它们的基因组序列特征,并分别克隆了欧洲、美国PRRSV ORF3、ORF5和PCV2 ORF2基因。这为进一步研究欧美PRRSV ORF3、ORF5和PCV2 ORF2基因的功能奠定了基础,并为下一步基因工程疫苗的设计提供了依据。

1种材料

1.1病毒和细胞

Marc-145细胞和PK15细胞保存在该实验室。基本培养基是含有10%胎牛血清的DMEM,在37℃和5%的CO2培养箱中培养。欧洲PRRSV低压毒株(GenBank登录号:M96262)由大连出入境检验检疫局捐赠。在该实验室中,从患病材料中分离、鉴定并保存了美国PRRSV CC菌株。将病毒接种到马克-145细胞培养物中进行病毒扩增,用里德-明希法测定其TCID50。它被分割并储存在。80℃备用。本实验室分离、鉴定并保存了猪圆环病毒2型纳米株。

1.2主要试剂

基因组脱氧核糖核酸和质粒少量提取试剂盒都是安盛公司的产品。经典的总核糖核酸提取试剂盒是上海生物工程公司的产品。原始脚本?逆转录试剂盒是TAKARA公司的产品。胎牛血清、胰蛋白酶和DMEM培养基都是杂交克隆产品。测试中使用的其他生化试剂为分析级。

第二章欧美PRRSV双价核酸疫苗的构建及小鼠实验免疫研究

控制和预防猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)的主要方法是免疫接种。目前,世界上许多地区都有一系列PRRSV疫苗产品。然而,自从美国在1994年研制出减毒活疫苗以来,尽管人们做了大量的工作,但在提高疫苗效力方面却收效甚微。关键的限制因素包括:(1)保护性免疫病毒靶位的不确定性阻碍了病毒结构和病毒蛋白的研究,使新疫苗的设计变得困难;无法确定免疫保护之间的明确关联。为了实现这一目标,需要对抗病毒模型进行大量的体内研究来评价抗病毒保护效果。(三)由于无法预测单一病毒隔离物的免疫保护如何发挥作用,而PRRSV的遗传多样性会导致交叉保护性免疫能力低下,我们需要小心进行抗病毒实验。许多野生型分离株具有显著的交叉保护作用,但这并不能保证自然界中存在的分离株具有有效的保护作用。在PRRSV疫苗的研发过程中,除了这些实质性的障碍外,我们在了解猪的免疫机制和过程方面还有大量空 white,正是这种未知的免疫机制和过程可能为PRRSV感染提供免疫力,并为长期感染提供记忆反应。尽管有这些困难,我们仍然相信会取得进展。猪基因组测序工作为我们提供了丰富的基因结构和转录调控基础知识,必将进一步揭示针对PRRSV的免疫机制。此外,许多研究人员正在不懈努力解开PRRSV和猪之间相互作用的细节,并最终产生新的理论和理解,可以解决这一领域现有的不足。

与传统疫苗相比,脱氧核糖核酸疫苗具有一些显著的特点:易于生产、价格相对低廉、均匀且热稳定,被认为比基于比亚单位或病毒载体的疫苗更安全。在过去的十年里,许多脱氧核糖核酸疫苗已经被制造出来并进行功效测试。已经报道了一些令人满意的结果,但是很明显,疫苗的免疫原性仍然需要提高。选择合适的佐剂和递送系统可以增强脱氧核糖核酸诱导的免疫反应。传统上,铝盐或弗氏佐剂是增加疫苗诱导反应的唯一可用方法。然而,分子生物学和基因重组技术的进步现在使得各种细胞因子和免疫调节分子可以应用于[255]。新一代的常规佐剂也已开发出来,并显示出在提高脱氧核糖核酸诱导的免疫方面的前景。此外,接种途径,包括肌肉注射、皮下注射、鼻内注射、基因枪注射或粉针剂注射,也将潜在地影响脱氧核糖核酸免疫的效果。

本实验将在实验1的基础上构建欧美PRRSV双价核酸疫苗。以刺参为佐剂,传递壳聚糖纳米粒免疫小鼠,检测各种免疫数据,分析构建的核酸疫苗的初步免疫效果。

1种材料

1.1病毒、细胞和质粒

Lelystad株病毒由大连出入境检验检疫局捐赠,高致病性pr RSV nm12株由我实验室从病料中分离鉴定保存。病毒培养基于DMEM,在37℃和5%的CO2培养箱中含有10%胎牛血清。马克-145细胞用于培养和传播病毒,用里德-明希法测定其TCID50。TCID 50被单独储存在80℃以备后用。BHK-21细胞保存在这个实验室里。pMD18-T-EU-ORF3、pMD18-T-EU-ORF5、pMD18-T-NA- ORF3、pMD18-T-NA-ORF5、pMD18-T-PCV-ORF2的重组质粒从第1章获得。

1.2主要试剂

T4连接酶和其他限制性内切酶购自大连塔卡拉生物工程公司。RPMI1640培养基是海克隆公司的产品。FITC标记的山羊抗猪IgG、辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG都是BOOSON公司的产品。基因转染试剂是罗氏应用科学公司的产品。本实验室制备了欧美PRRSV GP3和GP5的多克隆抗体。聚乙烯抗小鼠CD8a、聚乙烯/Cy5抗小鼠CD3ε、FITC抗小鼠CD4均为生物基因的产物。壳聚糖购自美国西格玛-奥尔德里奇公司。Quila佐剂是美国精确化学科学公司的产品。小鼠血清白介素-2、白介素-4、白介素-10、干扰素-γ酶联免疫吸附试验试剂盒?)是eBioscience公司的产品。小鼠淋巴细胞分离液是天津浩阳公司的产品。WST-1细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒是碧源生物技术研究所的产品。刀豆球蛋白是西格玛公司的产品。

第三章欧洲PRRSV和猪圆环病毒2型双核疫苗的构建及小鼠实验免疫研究...................63

1材料……63

方法……63

结果……65

4讨论..............................71

5摘要...................73

第四章是欧美PRRSV双价核酸疫苗和欧美PRRSV和猪圆环病毒2型双价核酸疫苗在猪体内的实验免疫。……75

1材料……75

方法……76

结果……79

第五章欧美PRRSV双价重组痘病毒疫苗和欧洲PRRSV和猪圆环病毒2型双价重组痘病毒疫苗的构建及猪的实验免疫研究........97

1材料……97

第五章欧洲型和美国型双价重组PRRSV疫苗和欧洲型双价重组PRRSV和猪圆环病毒2型疫苗的构建及猪的实验免疫

所有疫苗必须具有良好的安全性和免疫原性。特别是,它可以诱导产生适当的免疫反应类型,并介导较长的免疫期。更重要的是,新疫苗的大规模生产必须严格遵守规定。有许多类型的病毒疫苗,主要是亚单位疫苗,由与可溶性抗原混合的佐剂组成,其中一些是脂质体。(脂质体和病毒颗粒样疫苗);灭活疫苗通常使用福尔马林和β-甲醛等化学物质。灭活疫苗主要灭活病毒,而不是破坏病毒包膜蛋白的抗原性。活病毒疫苗,包括非致病形式的病毒。

灭活疫苗生产成本低,但免疫原性差,只能提供短期免疫保护。脂质体佐剂疫苗可以介导较长的免疫保护期,但价格昂贵。相对而言,弱病毒疫苗效果好,可以提供更长的保护,但其安全性仍需考虑,可用于常规先天性免疫规划。减毒疫苗可以大规模生产,但是大剂量免疫将导致更高的生产成本。近年来,病毒作为载体作为基因传递工具的应用有了很大发展。不同的脱氧核糖核酸和核糖核酸病毒可以作为基因传递载体来设计多样化的疫苗。痘病毒是一种基因组大小为150-300kb的双链脱氧核糖核酸病毒。脱氧核糖核酸复制发生在细胞核中。第一种重组病毒载体疫苗使用痘苗病毒作为载体。痘病毒载体可以很容易地通过基因手段操纵产生更高的病毒滴度,具有更好的稳定性,同时具有更高的安全性,并且可以维持或改善病毒载体的复制。这些优势已经得到许多同行的肯定。

结论

1.欧美PRRSV GP3和GP5蛋白及PCV2 ORF2编码蛋白具有良好的免疫原性,能有效诱导小鼠体液和细胞免疫应答。小鼠和猪的实验证明,欧洲PRRSV GP3蛋白具有增强GP5蛋白免疫原性的作用,两者的协同效果最好。

2.欧洲PRRSV和PCV2双价核酸疫苗pVAX-ORF2-EU-ORF3-ORF5能诱导猪机体特异性中和抗体和淋巴细胞的产生,并能有效抵抗LV株病毒的感染;欧美PRRSV双价核酸疫苗pVAX-NA-ORF3-ORF5-EU-ORF3-ORF5的CD8+T淋巴细胞增殖水平比美国型减毒疫苗免疫组高14%,在NM12病毒攻击后血液中病毒载量比美国型减毒疫苗组低7%。欧洲左心室株感染后,血液中的病毒载量显著低于空载体对照组51%。结果表明,二价核酸疫苗能显著减轻猪病毒性疾病的症状,抵抗病毒在组织器官中的感染和复制,在欧洲LV株和高致病性PRRSV NM12株的攻击下提供有效的交叉保护效率。

3.奎尔甲能增强核酸疫苗的免疫效果,增强核酸疫苗的免疫应答。Quil A被用作免疫佐剂,并且将脱氧核糖核酸-壳聚糖纳米颗粒递送用于核酸疫苗免疫,这是更好的脱氧核糖核酸免疫策略。

4.欧美PRRSV双价重组痘病毒疫苗rVV-NA-ORF3-ORF5 -EU-ORF3-ORF5和欧洲PRRSV和PCV2双价重组痘病毒疫苗rVV-ORF2- EU-ORF3-ORF5能有效诱导猪的特异性免疫应答,其中双价重组痘病毒疫苗rVV-ORF2-EU-ORF3-ORF5的最高中和抗体滴度比灭活疫苗免疫组高25%;CD4+和CD8+水平分别比灭活疫苗免疫组高19%和21%,明显高于野生病毒对照组。二价重组痘病毒疫苗RVV-NA-ORF3-ORF5-EU-ORF3-ORF5接种后,弱毒疫苗免疫组CD4+和CD8+水平分别高于11%和8%,弱毒疫苗组脾、肾和肝病毒载量分别低于15%、7%和26%。结果表明,二价和二价重组痘病毒疫苗能显著减轻病毒感染时的病毒血症症状,各组织器官的病毒载量也明显低于野生病毒对照组。

参考文献(省略)