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对研究山银花黄芩材料与方法,党参、生地、茯苓、防风、蝉蜕、黄芩、丹参、赤芍、金银花、...

对研究山银花黄芩材料与方法

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对研究山银花黄芩材料与方法范文

本文的目录导航:

[标题]黄芩提取物对肉鸡生长的影响
[第1章]黄芩化学成分和药理作用研究简介
[第2章]黄芩材料和方法研究结果
[第3章]提取物对肉鸡生长的影响
[第4章]植物提取物对黄芩和黄芩提取物应用的影响
[第5章-参考文献]

2材料与方法
2.1材料
2.1.1试验药品

山银花黄芩提取物,由爱迪森(北京)生物科技有限公司提供,批号:1302261.含量:每1g山银花提取物以绿原酸(C16H18O9)计,含量为2.40mg;每1g含黄芩提取物以黄芩苷(C21H18O11)计,含量为24.0mg.
阿司匹林泡腾片:购自阿斯利康制药有限公司,批号:1209021.规格:0.5g/片。
二甲苯,购自北京化工厂,纯度>99%,批号:20121203.
博落回散(主要是血根碱、白屈菜红碱),购自湖南美可达生物资源有限公司,产品批准文号:兽药字(2012)180415250.批号:20130205.
10%氧氟沙星溶液,购自北京普尔路威达兽药有限公司,批号:1310041J.
10%氧氟沙星可溶性粉:由爱迪森(北京)生物科技有限公司提供,批号:121121.
2.1.2实验动物及饲养管理
4~6周龄清洁级昆明种小白鼠(体重20±2g)210只,SD大鼠(体重200±20g)30只,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,雌雄各半,饲养条件:室温(22~25℃),相对湿度为65%±5%,12h明暗交替照明,自由进食、饮水。
1日龄爱拔益加(AA+)肉仔鸡公雏420只,购于北京昌平爱拔益加孵化场。试验鸡均饲养于标准鸡舍,自由采食、饮水,饲养密度控制为15只/m2,按照常规方法饲养管理,试验期间执行严格的防疫消毒措施。
7日龄,接种新-支二联活疫苗;14日龄,接种法氏囊疫苗。
2.1.3菌株、试剂和培养基金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌株由北京生泰尔科技股份有限公司研究院提供。
血液脂质代谢指标、血液抗氧化指标采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定,严格按照说明书进行操作。
血清免疫球蛋白,采用购自哈尔滨赛莱博公司试剂盒测定。
营养肉汤,普通肉汤琼脂培养基购自北京陆桥技术股份有限公司。
2.1.4主要实验仪器与设备
生物安全柜:BSC-1100ⅡA2-X,青岛海尔生物医疗设备公司
超净工作台:Theme Scientific 1829.SN.
17069-15CO2恒温培养箱:3000T型,美国REVCO公司
PH计:sartorius PB-10,赛多利斯科学仪器有限公司
移液器:Thermo Fisher公司
电子天平:FA1004N,上海精密仪器仪表有限公司
低温台式高速离心机:Beckman Avanti TM 30中国贝克曼库尔特商贸有限公司
进口电热恒温培养箱:DNP-9162型,上海精宏实验设备有限公司
电热恒温水槽:DK-80型,上海精宏实验设备有限公司
显微镜:OLYMPUS LMT-2型由日本OLYMPUS公司
生产微孔滤膜:0.22?m,南京禾汽化玻仪器有限公司
2.2试验方法
2.2.1山银花黄芩提取物的抗炎抑菌作用试验
2.2.1.1山银花黄芩提取物抗二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验

分别称取山银花黄芩提取物,以去离子水溶解制得浓度为256mg/m L、128mg/m L、64mg/m L的山银花黄芩提取物溶液。同法制得浓度为12 mg/m L的阿司匹林溶液,4℃备用。
将50只清洁级昆明种小白鼠置于室温(22~25℃),相对湿度为65%±5%,12h明暗交替照明,自由进食、自由饮水的条件下饲养。随机分为5组,每组10只,雌雄各半,分别为模型对照组、阳性药物组和山银花黄芩提取物高、中、低剂量组。模型对照组不给药,阳性药物组和山银花黄芩提取物低、中、高剂量组每天分别用阿司匹林溶液和山银花黄芩提取物低、中、高浓度的溶液对小鼠灌胃,剂量为0.5m L/20g,对照组灌胃同等体积的饮用水。连续给药7d.末次给药40min后,各组小鼠右耳内外涂以二甲苯20?l致炎,左耳作为对照,1h后将所有小鼠脱颈处死,沿耳廓根部剪下两耳,用打孔器(直径6mm)取下相同位置耳片,称重,以左右耳片的重量之差作为肿胀度,算出肿胀率(%)。
肿胀率(%)=(右耳重-左耳重)/左耳重×100%2.2.1.2山银花黄芩提取物体外抑菌试验(1)供试菌和山银花黄芩提取物供试品溶液的制备将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌接种到营养琼脂平板上划线接种,37℃培养,待细菌达到对数期时将典型的单个菌落接种在营养琼脂培养基斜面上传代,传至3代后的菌种即可作为供试菌种。将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌悬液分别进行活菌计数,用营养肉汤稀释成含菌约105~106个/m L的菌液,制为供试菌液。
精确称取山银花黄芩提取物5g,加去离子水溶解(以氢氧化钠溶液调p H值至7.0),溶解后过滤,滤液置于50ml容量瓶中,用去离子水定容,3000r/min离心5min取上清液,用0.22?m的滤器过滤除菌,得到的山银花黄芩提取物溶液浓度为100mg/m L,4℃备用。
(2)山银花黄芩提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外抑制作用取24支试管,分两组,每组12支试管,编号依次为1~12,按无菌操作法在2~12号试管中分别用移液管加入2m L营养肉汤培养基,再用移液管吸取山银花黄芩提取物溶液(100mg/m L)2m L放入每组的第1管和第2管,反复摇匀;从两组的2号管吸取2m L放入第3号管……,依次倍比稀释至9管,吸出2m L弃去,药物浓度则依次为100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39mg/m L.第10号管中加入氧氟沙星溶液,使其作为阳性对照,最终浓度为1.6?g/m L,第11号管作为阴性对照,第12号管作为空白对照,然后将0.1m L供试菌液分别加入两组试管的第1~11号管。置各试管于37℃培养箱中培养24h,观察细菌生长情况。如试管为浑浊,表示细菌已生长,该管浓度的药物无抑菌作用;如试管澄清,表示细菌生长受到抑制,则该管药物有抑菌作用,能抑制细菌生长的最低药物浓度作为山银花黄芩提取物的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。
2.2.1.3山银花黄芩提取物体内抗感染试验
(1)山银花黄芩提取物溶液及菌液的制备分别划线培养大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的菌株,挑选典型菌落接种普通肉汤琼脂培养基,37℃培养18~24h,连续传代3次,取菌落用普通肉汤培养基制成大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液。同时制得浓度为256mg/m L、128mg/m L、64mg/m L的山银花黄芩提取物溶液和32mg/m L的氧氟沙星可溶性粉溶液。
(2)体内抗感染预试验按无菌方法操作,将制备好的菌液用麦氏计数法分别制成1013、1012、1011、1010、109、108、l07、106cfu/m L的不同浓度大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液。将不同浓度的菌悬液分别腹腔注射体重20±2g的小鼠,每个浓度组5只小鼠,每只0.5m L/20g,记录7d内小鼠的死亡情况,分别找出大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液的最小致死量(minimum lethal dose,MLD),即感染后引起小鼠100%死亡的菌液浓度。
(3)体内抗感染试验将小鼠分5组,即山银花黄芩提取物低浓度组(64mg/m L)、中浓度组(128mg/m L)、高浓度组(256mg/m L)、氧氟沙星组(32mg/m L)、空白对照组。每天用山银花黄芩提取物低、中、高浓度溶液、氧氟沙星溶液对小鼠灌胃,剂量为0.5m L/20g体重,空白对照组灌胃同等体积的饮用水。灌胃7d后,以预实验所得最小致死量的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌浓度的菌液给各组小鼠腹腔注射感染,每只注射0.5m L/20g体重。注射菌液后第1h及6h,对各组小鼠分别再灌胃上述低、中、高浓度的山银花黄芩提取物溶液和氧氟沙星溶液,对照组小鼠灌胃同体积的饮用水,记录7d内小鼠的存活天数和死亡情况(小鼠在第1、2、3、4、5、6、7d死亡的,小鼠的存活天数分别记为0、1、2、3、4、5、6,7d内未死亡的记为7)。
2.2.2山银花黄芩提取物安全性试验
2.2.2.1山银花黄芩提取物急性毒性试验

将30只SD大鼠随机分成3组,每组10只(雌雄各半),每次取1组进行试验,重复3次,将山银花黄芩提取物用蒸馏水配制成0.5g/m L的混悬液,经口对SD大鼠进行灌胃,灌胃体积为2m L/100g体重。给药后观察大鼠的一般表现、中毒症状和死亡情况,并对死亡大鼠进行剖检,做好记录。观察时间为1周。
将30只清洁级昆明种小鼠随机分成3组,每组10只(雌雄各半),每次取1组进行试验,重复3次,将山银花黄芩提取物用蒸馏水配制成最大浓度为0.5g/m L的混悬液,经口对清洁级昆明种小鼠进行灌胃,灌胃体积为0.4m L/10g体重。观察小鼠的一般表现、中毒症状和死亡情况,并对死亡小鼠进行剖检,做好记录。观察时间为1周。
2.2.2.2山银花黄芩提取物临床推荐剂量研究

为了确定山银花黄芩提取物的临床推荐剂量及进行靶动物安全性试验,试验选取1日龄AA+肉鸡120只,随机分成6组,每组20只,分别为山银花黄芩提取物1、2、3、4、5组和空白对照组。山银花黄芩提取物1、2、3、4、5组分别在饲料中以0.25g/kg饲料、0.375g/kg饲料、0.50g/kg饲料、0.625g/kg饲料、0.75g/kg饲料的剂量添加山银花黄芩提取物,连用42d;空白对照组正常饲喂(无药物添加)。试验期间记录各组肉鸡的采食量,每日称体重,计算平均日增重、平均日采食量、料重比以及死淘率。
平均日增重(ADG)=[总末重-(初始总重-初始均重×死淘只数)]/[试验天数×(试验只数-死淘只数)]平均日采食量(ADFI)=总耗料/(试验天数×试验末只数+死淘饲养天数×死淘只数)料重比(F/G)=饲料消耗量(kg)/增重(kg)死淘率=发病和死亡鸡数量/试验鸡只数×100%
2.2.2.3山银花黄芩提取物靶动物安全性试验
为了研究山银花黄芩提取物对肉鸡临床用药的安全性,本研究将120只1日龄爱拔益加(AA+)肉鸡随机分为4组,每组30只,分别为山银花黄芩提取物5倍、3倍和1倍临床推荐剂量组和空白对照组。山银花黄芩提取物5倍、3倍和1倍剂量组分别将山银花黄芩提取物以2.5g/kg饲料、1.5g/kg饲料和0.5g/kg饲料的剂量混饲,空白对照组正常饲喂,连续给药50d.试验期间观察各组试验鸡的一般体征、生长性能、免疫器官指数及临床剖检情况。
2.2.3山银花黄芩提取物对肉鸡生长的研究
2.2.3.1实验动物分组及饲喂程序

选用180只1日龄爱拔益加(AA+)肉仔鸡公雏随机分配到3个组,分别为空白对照组(无添加剂组),阳性对照组(博落回散)以及山银花黄芩提取物组,每个组设6个重复,每个重复10只鸡。基础日粮参照NRC(1994)和中国鸡饲养标准(NY/T-33-2004)配制。试验期42d.采用立体网上养殖。山银花黄芩提取物组在基础日粮中添加量为500g/t.试验尽量使每个重复分开,3个组的各重复均匀分布于控制温度的鸡舍内。基础日粮组成及营养含量见表2-1;饲料原料相同。采用冷压制粒,以颗粒料形式饲喂。自由采食,自由饮水。每日清晨8:30和下午2:30分别记录鸡舍温度和湿度,定时清扫卫生。每周结料一次,以重复为单位对鸡称重一次,记录增重、采食量、死亡数等基本数值。

2.2.3.2生长性能测定
分别于1、21日龄和42日龄以重复为单位整体称重,计算平均日增重、平均日采食量、料重比以及死淘率。
平均日增重(ADG)=[总末重-(初始总重-初始均重×死淘只数)]/[试验天数×(试验只数-死淘只数)]平均日采食量(ADFI)=总耗料/(试验天数×试验末只数+死淘饲养天数×死淘只数)料重比(F/G)=饲料消耗量(kg)/增重(kg)死淘率=发病和死亡鸡数量/试验鸡只数×100%2.2.3.3血液理化指标测定分别于 21 和 42 日龄,各组以重复为单位随机选 1 只肉鸡,翅静脉采血 3 m L,促抗凝管存放,自然析出血清后将血清移至离心管中,离心 10 min,转速 3000 r/min,上清液分装于1.5 m L eppendof 管中,置-30℃冰箱保存待用。
血液脂质代谢指标:总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量、甘油三酯(TG),采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定,严格按照说明书进行操作。
血液抗氧化指标:总抗氧化力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD),南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定,严格按照说明书进行操作。
2.2.3.4免疫指标测定
①血清溶菌酶(LZM)含量21 和 42 日龄,各组以重复为单位随机选 1 只肉鸡,从翅静脉采血,并离心制备血清,冷冻(-20 ℃)待测。按 Kreukniet 等(1994)方法,测定血清溶菌酶活性,用溶壁微球菌细胞作为底物。
②免疫器官指数分别在 21 和 42 日龄颈部放血屠宰鸡 1 只,摘除脾脏、胸腺、法氏囊,称重,计算占体重之比。器官指数=器官重量(g)/活体重(kg)×1000.
③免疫球蛋白测定21 和 42 日龄,测定血清免疫球蛋白。免疫球蛋白 G(Ig G)、免疫球蛋白 M(Ig M)、免疫球蛋白 A(Ig A)采用双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA),采用市售试剂盒测定。
2.2.3.5肠道形态
于 42 日龄,以重复为单位随机选取 1 只体重接近该重复平均值的肉仔鸡,进行屠宰,剥离出十二指肠和空肠,缓缓的用冰冷的生理盐水冲洗干净,浸入 p H=7.4 的福尔马林溶液,保存在 4℃冰箱,以备制作石蜡切片。采用甲苯胺蓝法染色,在光学显微镜下观察,每个切片随机抽取 5 个非连续性视野,每个视野统计 3 组数据,测绒毛高度、隐窝深度,计算绒毛高度/隐窝深度(VCR)。绒毛长度是指绒毛顶端到绒毛基部的长度,隐窝深度是指肠腺底部到两绒毛之间基部开口处的距离。
2.2.3.5数据统计分析
数据以平均数±标准差表示。采用SPSS(15.0)软件的ONE-WAY ANOVA对各组先进行方差齐次性检验,再进行F检验和Duncan氏多重比较。