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38000字论文范文组织工程肝脏仿生三维细胞网络的计算机辅助构建

论文类型:论文范文
论文字数:38000字
论点:细胞,公司,培养液
论文概述:

探讨小鼠骨髓源性间充干细胞(mesenchymal stem cells MSCs)体外培养、鉴定、分化的方法,研究间充质干细胞在体外环境下向内皮细胞分化的效率和功能变化。

论文正文:

第一部分

前言

间充质干细胞是第一批从骨髓中分离出来的非造血间充质细胞。随后在成人的其他结缔组织中发现间充质肝细胞。它能增殖并分化成多种结缔组织细胞,如神经细胞[6号、骨软骨细胞、间充质细胞和骨髓基质细胞[24_26]。当组织受损、发炎或坏死时,间充质干细胞通过分子信号诱导间充质干细胞激活和修复组织[27]。静脉注射骨髓间充质干细胞可发现骨髓间充质干细胞迁移至损伤部位。这种修复功能已在心肌梗塞、骨折、脑缺血([31_32)、脊髓损伤([33)等情况下得到证实。一些研究发现,在受伤的膝关节附近皮下注射骨髓间充质干细胞可以再生受伤的软骨和半月板[34]。
分离骨髓间充质干细胞有三种主要方法:(1)全骨髓单层培养法。由于骨髓腔中仍有少量的细胞外基质,提取的骨髓可以通过机械方法(如吹打)容易地粉碎基质,以均匀地击打细胞。细胞接种到培养皿后,骨髓基质干细胞可以快速附着在培养皿上,不具有粘附能力的造血干细胞可以通过反复换液来去除。(2)密度梯度离心:抗凝血处理后,将骨髓样品转移到装有密度为1.073的密度梯度溶液的离心管中,室温离心,大部分红细胞沉淀,有核细胞被界面和上层液体吸收,培养有核细胞。(3)根据骨髓间充质干细胞表面标记,采用流式细胞仪进行分选。
由于骨髓腔中含有少量细胞外基质,提取的骨髓易于通过机械方法将造血细胞和间充质干细胞分离成单细胞状态,低密度接种后骨髓基质干细胞可快速附着于细胞培养皿,造血干细胞可通过反复的液体交换去除。我们首先用佩尔科尔密度梯度离心法从骨髓中分离单核细胞,然后将它们接种到培养皿中进行贴壁蹄选择和扩增。通过加入血管内皮生长因子,诱导骨髓间充质干细胞分化为内皮细胞,为骨髓间充质干细胞在血管内皮修复和血管生成中的应用奠定了细胞学基础。
材料和方法

1实验动物
40只健康C57BL/5J小鼠,体重2 ()+5g,一半雄性,一半雌性。复旦大学上海医学院动物实验室被购买和保存。环境是SPF,动物可以自由进食和饮水。动物的使用符合上海市动物管理委员会的规定。

2主试剂
DMEM低糖培养基吉布科公司
DMEM高糖培养基吉布科公司
胎牛血清(牛血清, FBS)吉布科
M199培养基吉布科
血管内皮生长因子(VEGF)佩普洛特奇
兔抗小鼠VWF单克隆抗体横标
兔抗小鼠CD34单克隆抗体横标[公司/br/]FITC标记兔抗小鼠CD29单克隆抗体横标[公司/br/]FITC标记兔抗小鼠CD105单克隆抗体横标公司
PE标记兔抗小鼠CD45单克隆抗体横标公司
PE标记 6-二氨基-2-苯基氮降噪(DAPI)西格玛公司
MTT西格玛公司
淋巴细胞分离液(Percoll)西格玛公司
矩阵胶BD公司
酸式盐缓冲液(PBS)吉布科
二甲基亚砜(DMSO)西格玛
迪尔标记的乙基丑陋低密度脂蛋白(Dil-acdl)西格玛
FITC标记的精道凝集素1 (FITC-UEA-1)西格玛

3主要仪器设备
洁净工作台苏州净化设备有限公司
二氧化碳培养箱Heraeus公司
倒置相差显微镜奥林巴斯公司
倒置投影显微镜奥林巴斯公司
奥林巴斯公司
激光共焦显微镜徕卡公司
电子分析天平上海精密科学仪器有限公司
高速台式离心机上海安亭科学仪器厂
电加热恒温水浴箱
Midi Plus电动移液器上海大隆医疗设备有限公司 [有限公司/br/]移液管枪微孔板读取器bio-rad公司
流式细胞仪BD公司
低温冰箱(-20℃,-80℃),日本三洋公司
细胞培养皿(直径35毫米、60毫米和100毫米),离心管(15毫升和50毫升),移液管(1毫升、10毫升、25毫升),细胞冷冻管,96、24、6孔细胞培养板上市公司

4主溶液的制备
1ml99培养液
溶液组分含量
ml99培养基
胎牛血清10%
青霉素-链霉素100单位/ml
血管内皮生长因子5 ng/ml
依次将上述组分加入M199培养基中,每瓶分装500毫升,保留
2mm培养液的组分
溶液
DMEM低在4℃保存备用
3月
DMEM低糖培养液
胎牛血清10%
双抗体100单位/毫升
地塞米松l [nnol/ L
吲哚美辛环imol/l
胰岛素lomg/L
1-甲基-3-异丁基黄原酸0.5 mmol/l

3毫升溶液(5毫克/毫升):取[/溴/]甲基叔丁基醚10毫克,溶解于20毫升PBS中,用0.22分钟的一次性过滤器过滤灭菌,分装后在-20℃避光保存。

4细胞冷冻保存溶液
二甲亚砜:胎牛血清:培养液= 1: 1: 8,加入二甲亚砜,胎牛血清加入培养液中,分装,并在4℃保存备用。

5试验方法
1小鼠骨髓间充质干细胞的分离,1.20 g健康C57BL/6J小鼠的培养,颈椎脱位法杀死小鼠,完全浸泡在75%乙醇中5min,在超净工作台上解剖小鼠股骨和腔骨,注射器抽取DMEM低糖培养液(含肝素lOu/ml),冲洗骨髓腔3-4次,冲出骨髓细胞,轻轻吹制成单细胞悬液。
2)将上述细胞悬浮液以1∶1的比例缓慢加入到预设密度为1.073的细胞分离溶液的试管中,并在室温下水平离心2000转/分钟20分钟。
3)离心后可以看出,试管分为四层,上层是血拱、细胞培养液和血小板,中间层是淋巴细胞分离液,下层主要是红细胞和多核白细胞,上层和中间层之间形成一层云状单核细胞层。
DMSO: FBS:培养液= 1: 1: 8,加入DMSO,将FBS加入培养液中,分装并储存于4℃备用。
4)吸收云状单核细胞层,加入DMEM低糖培养基,以1500转/分钟离心3分钟。
5)洗罗两次。将细胞重新悬浮在DMEM低糖培养基(10%胎牛血清)中,混合后计数,接种在lxl04/ml的细胞培养皿中,并在37℃的5% CO2细胞培养箱中培养。
6)接种48小时后,轻轻洗涤PBS以除去粘附细胞,并用新鲜培养液代替。
7)每三天更换一次液体,并在倒置显微镜下观察细胞生长和细胞形态。当细胞在大约一周后生长至80%融合时,进行0.25胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化,并按照1∶4的比例传代细胞。

2骨髓间充质干细胞的流式鉴定

1)传代扩增后取上述P2代细胞,用0.25%胰酶-乙二胺四乙酸消化3分钟,用DMEM-LG(10%胎牛血清)终止消化,以1500转/分钟离心3分钟,用PBS溶液洗涤,再以1500转/分钟离心3分钟,用PBS溶液将细胞浓度调节至l >

第二部分:...............................................可降解聚电纺薄膜30-41 [标志/br/]前言......................................................30
材料和.................................................................................30-33
结果....................................................................33-38讨论了
.............................................38-40
......................................................40-41
第三部分:聚氯乙烯/血管内皮生长因子电纺支架的制备.........................................41-60
前言.................................................41
材料和.................................................................................41-48
结果....................................................................................48-57
For....................................................................................57-59
........................................................................................59-60
第四部分:........................................................仿生肝血管网60-74

结论:

组织工程组织的构建旨在修复组织和器官缺陷。组织工程器官的临床应用将进一步改变目前的医学模式,将再生医学应用于疾病的治疗,给医学的发展带来翻天覆地的变化。

参考

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