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44000字论文范文利用水稻原生质体瞬时表达系统研究BA诱导抗氧化保护的作用

论文类型:论文范文
论文字数:44000字
论点:诱导,瞬时,表达
论文概述:

本文为植物论文,主要论述我们利用水稻原生质体瞬时表达体系过表达OsHK3,发现过表达0通3能诱导抗氧化防护系统中沉)Z)Cc2、APXA. CATB表达量显著上调,SOD、APX、CAT总活性大幅增强,SOD、APX总活

论文正文:

第一章文献综述1脱落酸与植物抗氧化保护的关系

 1.1干旱胁迫诱导ABA的积累干旱是植物逆境最常见的形式,植物响应干旱胁迫的一个重要反应是积累ABA。ABA作为重要的信号分子,在提高植物抗旱性方面起着重要作用(Zhu, 2002)。Xiong等(2001)报道在逆境条件下,植物体ABA的合成途径被激活,降解途径受到抑制(图1-1)。随着胁迫的消失,ABA迅速降低至原来的低水平(吴耀荣等,2006)。在ABA合成途径中,玉米黄质环氧化酶(ZEP)、9\'-顺式-环类胡萝卜素双加氧酶(NCEB)、酸加氧酶(AO)可能起重要作用。高等植物中,响应水分胁迫过程中的ABA积累是植物适应干旱或其它逆境过程中的最初信号。当杭物受到环境胁迫时,会引起ABA的积累,继而启动适应性反应,提高杭物的抗逆性。早在20世纪60年代末,Wright和Hiron(1969)就证明了渗透胁迫可诱导细胞合成ABA,其含量是鉴定植物抗旱性的重要指标。ABA能关闭气孔或抑制气孔幵度,降低细胞膜透性,诱导SOD合成(吴新江等,1998)。ABA的积累是一个细胞信号过程。干旱胁迫能诱导编码ZEP、NCED、AAO的基因的表达(Qin and Zeevaart, 2002)。 1.2 ABA诱导植物细胞抗氧化防护系统ABA通过复杂的信号转导级联,在植物受到胁迫时诱导多种细胞反应(Zhu,2002)。越来越多的证据表明,ABA增强植物的抗旱性主要或部分依赖于其诱导的抗氧化防护系统(Jiang and Zhang,2004)。Jiang和Zhang (2001)研究了水分胁迫下ABA积累,ROS产生以及抗氧化防护系统之间的关系,认为水分胁迫可以诱导ABA积累,从而激发ROS的产生,诱导抗氧化酶活性的增加。研究发现在冷(Andersonera/.,1994;Prasad et al.,99A)> 高温(Gong and Chen, 1998)、盐(Bellaire et ah, 2000)、水分胁迫(Jiangand Zhang,2002c)条件下,ABA都能增强植物抗氧化防护水平。............ 第二章ABA诱导的水稻基因克隆,序列分析及亚细胞定位1材料和方法1.1实验材料1.1.1植物材料以梗稻品种徐稻4号为实验材料。釆用水培法培养。筛选饱满一致的徐稻4号种子用10%次氯酸钠消毒15min,自来水冲洗3次后,种子经浸种(28 °C,48 h),催芽(28 °C,24h)后,播种于塑料容器中。在光照培养箱中(28 °C,RH90 %,光/暗为16 h/8 h)水培育苗。选取生长良好、发育状态一致的三叶期幼苗,进行下一步处理作为克隆基因的材料。 1.1.2菌株及载体大肠杆菌DH5a购自天根生化科技(北京)有限公司,PMD19-T Vector购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司,原生质体瞬时表达载体pXZP008载体由南京农业大学章文华老师惠赠。 1.1.3酶及主要分子生物学和生物化学试剂TaqDNA聚合酶、LA TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶Kpn I、dNTP、X-gal、IPTG、oligo d(T)18、Ribonuclease Inhibitor 购自TaKaRa 宝生物工程(大连)有限公司;DNA分子量标准和DNA快速回收纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;PEG4000为Fluka公司产品;纤维素酶R-10、离析酶R-10为日本Yakult Honsha产品;IPTG、X-gal、Amp、MES、甘露糖醇为Sigma产品。其它试剂均为国产分析纯。......... 1.2ay//K5基因克隆 1.2.1引物的设计根据GenBank上己知植物的OsZ/K?序列和实验要求,设计特异性引物(由上海生工公司合成)。 1.2.2植物总RNA提取1)取0.1 g水稻叶片,在液氮中充分研磨,加1.0mlRNA提取试剂,震荡混匀,室温放置5 min;2)加0.2ml氯仿,上下颠倒混均,室温放置5 min;3)12,000 rpm 4 °C离心15inin,取上清;4)加等体积异丙醇,混匀,室温放置lOmin;5)12,000 rpm 4 °C 离心 lOmin,弃上清,加 1ml75%乙醇;6)12,000 rpm 4 °C 离心 1 min,弃上清;7)吹干;8)W20^iLRNase-freeH20 溶解 RNA,-70 °C 保存。........... 第三章利用水稻原生质体瞬时表达体系研究过表达OsHK3对抗氧化防护酶活性及基因表达的影响...........351材料与方法...........372结果与分析...........403讨论...........43第四章利用水稻原生质体瞬时表达体系瞬时沉默OsHK3对抗氧化防护酶活性及基因表达的影响...........451材料与方法...........472结果与分析...........513讨论...........56 第四章利用水稻原生质体瞬时表达体系瞬时沉默OsHK3对抗氧化防护酶活性及基因表达的影响 1材料与方法 1.1实验材料 1.1.1植物材料以粳稻品种徐稻4号为实验材料。 1.1.2酶及主要分子生物学和生物化学试剂MyiQ 荧光定量PCR仪,Allegra 64R型高速冷冻离心机(Backman),TG16-W型台式高速离心机(湖南湘仪),DK-S26型水浴锅(上海精密实验设备有限公司),HE-120水平电泳槽(上海天能科技有限公司),PowerPac 3000电泳仪(Bio-red),SW-CJ-1FD型超净工作台(苏净集团安泰公司),凝胶成像系统(Bio-red),PCT-200型PCR 仪(Bio-red)。......... 全文结论 1研究小结 1.1OsHK3基因的克隆、生物学分析以及亚细胞定位我们通过RT-PCR方法扩增OsHK3完整的基因编码区。OsHK3具有典型的HK保守结构域:CHASE域、传递域、接受域。根据预测分析,OsHK3还有两个跨膜域。同时,OsHK3具有关键的保守位点:HisKA区中可被碟酸化的His残基和REC中接受憐酸基团所必须的DDK保守序列,表明OSHK3可能具有完整的组氨酸激酶活性。通过亚细胞定位实验,我们初步确定OsHK3定位于细胞质和细胞膜上。 1.2 OsHK3参与了 ABA诱导的抗氧化防护应答我们利用水稻原生质体瞬时表达体系过表达OsHK3,发现过表达0通3能诱导抗氧化防护系统中沉)Z)Cc2、APXA. CATB表达量显著上调,SOD、APX、CAT总活性大幅增强,SOD、APX总活性提高了 2-3倍,CAT总活性也有了明显的增强。外源ABA处理能显著提高抗氧化防护酶SOD、CAT、APX活性和基因的表达。瞬时沉默后,S0DCc2、APXA. CATB表达量显著降低,SOD、APX、CAT活性也大幅下降,SOD、APX总活性分别降低50%和40%,CAT总活性也明显降低,ABA处理也不能使之恢复到对照水平。综上所述,我们认为OsHK3确实参与了 ABA诱导的抗氧化防护应答。2创新之处首次研究了OsHK3与ABA诱导的抗氧化防护应答的关系,初步确定了OsHK3参与了ABA诱导的抗氧化防护反应。利用水稻原生质体瞬时表达体系从基因瞬时过表达和瞬时沉默两方面研究OsHK3的功能。3存在的问题植物原生质体不能代表整个植株,原生质体瞬时表达体系与稳定转化体系相比还存在一定的缺陷,实验结果需要蹄选突变体作进一步验证。本实验初步确定了OsHK3定位于细胞膜和细胞质中,需要使用自身启动子,对各个细胞器染色进一步确定OsHK3的具体定位。参考文献(略)