40000字硕士毕业论文甲基转移酶基因异源表达对植物抗逆性的影响分析

论文类型：硕士毕业论文

论文字数：40000字

论点：植物,转基因,离子

论文概述：

本实验中将MCT基因转入了非盐生植物烟草中进行异源表达，达到提高植物对氯的耐受力的效果。同时通过转基因手段对甲基^化物外排机制的调控，实现植物自身微量、持续释放CHbBr,能够抑制植

论文正文：

第一部分是文献综述

1。植物耐盐机制
目前，土壤盐渍化是一个世界性的生态和资源问题。它一直是导致作物减产、阻碍农牧业快速发展的主要因素，也是植物学家面临的难题。土壤盐渍化发生后，直接导致土壤溶液渗透压的增加，土壤透水性和透气性的恶化，土壤中有效养分的减少，使植物无法正常生长。为了提高盐碱地的利用率，国内外许多学者开始研究盐胁迫对各种植物理化性质和细胞结构的影响。根据植物对盐分的耐受性，我们将其分为盐生植物、非盐生植物和甜土壤植物。盐生植物是指能够在渗透压超过0.33兆帕(相当于70rmnol/L单价盐)的盐渍土壤中正常生长并完成其生命周期的天然植物群。据统计，世界上有1560多种盐生植物，其中中国有424种，约占世界盐生植物总数的1/4。甜土壤植物通常对逆境没有抵抗力或抵抗力差。它们在生长发育过程中只能承受缓慢的脱水过程，但不能承受自身的快速脱水。外部高盐环境可引起甜土植物的离子胁迫、渗透胁迫和次生胁迫，如养分失衡和氧化胁迫。这些变化严重干扰植物中水分的维持和离子体内平衡的形成，造成植物细胞和分子的损伤，减缓生长甚至死亡。

1.2植物耐盐的生理机制
植物自身将积极经历一系列变化以适应逆境，包括光合作用强度和途径的变化、蛋白质合成、脂质和能量代谢的变化、细胞内渗透保护物质的增加、膜结构的变化、离子流出或分隔以及植物自身生长周期的加快。这些变化使植物的结构和功能保持一致。自1989年基尔斯特首次报道耐盐海藻以来，植物耐盐机制得到了广泛研究。这为海洋水产养殖、盐碱地开发和生态保护提供了强有力的理论基础和技术平台。1990年，BrecklS根据盐生植物的生理和形态特征将盐生植物分为三种生理类型:真盐生植物、假盐生植物和反盐生植物。一般来说，盐生植物的耐盐性最高，其次是盐生植物和假盐生植物。不同种类的泌盐植物的耐盐性差异很大，有独特的适应逆境的方法。例如，补血草属和柽柳属植物有盐腺，而滨藜属植物有盐囊结构，能有效排出多余的盐，从而维持体内的盐平衡。此外，盐生植物还可以减少根对离子的吸收，阻止离子向地上部分的迁移，从而降低地上部分的盐离子浓度，维持体内离子的平衡。然而，细胞内调节仍然是植物耐盐性的主要控制方法。

1.2.1细胞中的离子分隔
盐生植物和非盐生植物通常都具有离子分隔能力，但它们的离子分隔功能不同。在盐的条件下，植物细胞不可避免地吸收和积累大量的盐。对盐胁迫敏感的植物，为了减少盐离子对自身的毒性作用，会将吸收的过量盐离子运输到旧组织的细胞质中储存，抛弃旧组织，保护新组织的正常生长。与对盐胁迫敏感的植物相比，耐盐植物通常将过量的盐离子转运到液泡等非活性部位储存，从而降低细胞中盐离子的浓度，避免它们对细胞质区域的毒性作用。细胞内离子的这种划分也在调节渗透压中发挥作用。离子分隔依赖于多种跨膜蛋白质和离子通道蛋白质。细胞膜和液泡膜上的钠/氢反向转运载体调节钠离子的定向转运。它的能量来自于通过三磷酸腺苷或质子泵抑制剂水解而共存于膜上的氢+-三磷酸腺苷酶(V-ATPase)和氢+-PPase氢离子输送泵产生的能量。

2。甲烷酶促反应的研究进展

2.1卤代甲基溴(CH3X)和环境
自20世纪30年代以来，含氯氟烃(CFCs)以其优异的物理和化学性能占领了制冷剂、灭火剂、发泡剂和其他化学产品的市场。然而，在应用这种产品近半个世纪后，科学家发现这种物质对大气层平流层中的臭氧有很强的破坏性影响，这相应地导致温室效应的产生，并对全球生态环境和气候变化产生巨大影响[43]。从那时起，科学家们开始了对卤代烃的广泛研究(VHC)。卤代甲烷的组成包括甲基和卤原子。在这些有机化合物中，更常见的是氯甲烷(CH3C1)、甲基溴(CHsBr)和甲基碘(CHgl)。这些有机化合物分解后得到的无机卤素气体，如氯、溴和碘，对臭氧层有很强的破坏力，可以阻挡大气中紫外线辐射的杀伤作用。由于氟原子的高活性，氟甲基庭院在自然界中几乎不存在。像VHC一样，大气中的卤代甲基溴是一种卤素载体，它将氯离子和溴离子带到大气的平流层，对臭氧具有很大的破坏性。它们也与其他气候现象的变化有关。在整个大气环境中，氯甲基堤岸的体积分数约为600X10i2，其生存寿命约为1.3-1.5a，而甲基溴的平均摩尔分数约为9 X10”2，其生存寿命约为0.6-0.9a。然而，即使大气中溴甲基溴的浓度不如氯甲基高，其臭氧破坏能力也不容忽视。因此，第一代甲基溴含量的动态变化直接影响臭氧层的恢复，对整个地球生态系统有着非常重要的影响。然而，甲基溴是一种在世界上广泛使用的熏蒸剂，用于温室等农业设施。《联合国蒙特利尔公约》要求发展中国家在2015年前停止使用这种广谱熏蒸剂。因此，迫切需要开发一种新的能够满足环境要求的甲基溴替代技术。

2。实验方法..........................................27-37
2.1转基因烟草抗逆性分析.........................................27-30
2.1.1转基因烟草卤素甲烷释放量的测定.........................................28[/比尔/] 2.1.2转基因烟草的耐盐性.........................................28-29[/溴/] 2.1.3转基因烟草中氯离子含量的测定.........................................29
2.1.4钠离子.........................................29
2.1.5转基因烟草中叶绿素含量的测定.........................................29-30
2.1.6转基因烟草生物量的测定.........................................30[/溴/ ] 2.2质子核蛋白的表达、纯化和蛋白活性的测定.........................................30-37 [/BR/] 2.2.1原核表达载体的构建.........................................30-34[/br/ ] 2.2.2质子化蛋白的表达和纯化.........................................34-36[/溴/] 2.2.3酶活性的测定.........................................36-37
3。实验结果与分析.........................................37-47
3.1转基因烟草抗逆性分析.........................................37-38
3.1.1转基因烟草卤素甲烷释放量的测定.........................................37-38[/溴/] 3.2转基因烟草的耐盐性.........................................38-41
3.2.1转基因烟草中氯离子含量的测定.........................................38[/溴/] 3.2.2钠离子.........................................38-39
3.2.3转基因烟草中叶绿素含量的测定.........................................39-40[/溴/] 3.2.4转基因烟草中生物量的测定.........................................40-41[/溴/]3.3 MCT基因的原核表达.........................................41-47
4。讨论和分析.........................................47-50

结论

卤代甲基转移酶MCT在生物领域仍然是一种鲜为人知的酶，因为其最初的发现属于环境科学的范畴，甲基溴和氯甲烷可以通过卤代甲烷-甲基转移酶的催化作用形成，所以对MCT的研究大多集中在其源和汇相关植物MCT。本实验将MCT基因转入非盐生植物烟草中进行异源表达，以提高植物对氯的耐受性。同时，通过转基因手段调控甲基化合物流出的机制，可以实现植物自身对CHbBr的微缓释，抑制植物线虫病，达到减少外源化学物质使用量的目的，为其奠定一定的应用生物基础。转基因烟草和野生型中卤甲烷释放量的分析结果表明，转基因植物中氯甲烷、溴甲烷和碘甲烷的释放量明显高于野生型对照，高达200倍左右。转基因烟草的
线虫抗性试验表明，转基因烟草在br处理下能释放更多的CHsBr，在一定程度上抑制了转基因烟草的线虫感染，转基因植物中线虫的数量明显低于野生型。土壤盐分是制约烟草生长的主要因素之一。它不仅降低了烟草的产量和质量，而且使土壤变硬，降低了土壤的利用率。盐处理后测定野生型和转基因烟草的生理指标。结果表明，转基因烟草耐盐性明显高于野生型烟草。然而，氯离子含量的测定是出乎意料的，没有可遵循的规则。盐生植物从体内释放过量氯离子的机制有许多选择，其中之一是通过渗透调节将氯离子释放到土壤中。然而，还有另一种可能性，即细胞中的氯离子以氯甲烷气体的形式排放到空气体中。
植物中氯离子含量不稳定可能是由于以下原因:1 .尽管转基因烟草可以连续排放卤代甲烷，但是植物的排放量相对于它们所暴露的氯离子毒性来说非常小，并且气体的排放量不会显著影响植物中的氯离子含量。第二种可能性是卤甲烷气体的排放只影响细胞质中的氯离子浓度，但不能影响储存大量应激离子的液泡中的离子浓度。然而，本实验采用的测量方法不能将液泡与细胞质分离，因此有必要在细胞水平上测量离子浓度的变化进行研究和分析，而植物水平上的离子变化不能反映MCT基因对植物耐盐性的调节反应。