40000字硕士毕业论文农产品蛋白酶基因工程的构建及应用分析
论文类型：硕士毕业论文
论文字数：40000字
论点：蛋白酶,肽酶,蛋白
论文概述：
未改性的大豆分离蛋白对冰淇淋的感官品质有不好的影响当未改性和酶改性后大豆分离蛋白的替代率在 5%时，冰淇淋的粘度和膨胀率和达均达到最高，且融化率最低。改性后的大豆分离蛋白可以
论文正文：
第一章导言
1.1中性蛋白酶基因克隆和表达的研究现状
蛋白酶是一大类能催化蛋白质肽键断裂产生游离氨基酸、小肽或肽片段的酶的总称，也称为蛋白酶解酶(Protelytices)，它们与脂肪酶、淀粉酶和果胶酶结合，是工业上使用的四种主要酶。根据作用于肽链的酶的位置分类，蛋白酶通常可分为内肽酶和外肽酶。内肽酶也叫蛋白酶，它的优先作用位置在肽链的内部区域，远离N端或C端。酶的活性受游离氨基或羧基的影响。内肽酶从内部切割蛋白质分子，而外肽酶将蛋白质分子的游离氨基或羧基端的肽键一个接一个地水解成游离氨基酸。前者是氨肽酶，而后者是羧肽酶。工业
生产中常用的蛋白酶主要是内肽酶。蛋白酶存在于动物内脏、植物茎叶、水果和微生物中。微生物蛋白酶主要由霉菌和细菌产生，其次是酵母和放线菌。蛋白酶，由于其功能、结构和特性的多样性，通常不能用国际生物化学联合会常用的学名表达，通常有共同的名称。例如，根据酶作用的底物或产生蛋白酶的组织，水解胶原蛋白的蛋白酶称为胶原酶，胰腺产生的蛋白酶称为胰蛋白酶等。根据酶的最佳催化温度，可分为低温蛋白酶、中温蛋白酶和高温蛋白酶。根据酶的活性中心和最适酸碱度，蛋白酶可分为丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、巯基蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。根据反应的最佳酸碱度，可分为酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶。中性蛋白酶(杆菌蛋白酶)是枯草芽孢杆菌分泌的一种主要胞外内肽酶，可用于各种蛋白质水解处理。在一定的温度和酸碱度下，大分子蛋白质可以水解成氨基酸等产品。可广泛用于动植物蛋白水解生产HAP和HVP，用于生产高级调味品和食品营养强化剂，也可用于皮革脱毛、软化、羊毛和蚕丝脱胶等。
1.1.2中性蛋白酶
酶的应用已有1000多年的历史。虽然中性蛋白酶是人类发现的最早的蛋白酶制剂之一，并应用于工业生产，但其广泛应用仍是近几十年的事情。随着科学技术的飞速发展，以及酶制剂、酶和细胞固定化、酶分子修饰等酶技术的发展，中性蛋白酶的应用范围也在不断扩大。自上个世纪以来，世界各地的研究人员一直致力于中性蛋白酶产生菌的筛选、酶的提取和纯化以及酶学性质的研究和应用，并取得了一定的成果。中性蛋白酶的应用主要分为以下几个方面:面粉在食品工业中的应用是焙烤过程中的重要原料。研究发现，由老面粉制成的面包体积小，颜色差，因为它的酶活性低，发酵能力低。在老化面粉中添加中性蛋白酶不仅可以改善面包的品质，还可以缩短混合时间，提高面包的发泡性。细菌中性蛋白酶可用于改善面团的延展性和韧性。真菌中性蛋白酶和碱性蛋白酶在豆酱加工中起着极其重要的作用。大豆蛋白中添加真菌中性蛋白酶可提高产量20%-30%。大豆酶解产物的苦味极大地限制了其在食品和保健营养中的应用。其苦味强度与肽链中心疏水氨基酸和脯氨酸残基的量有关。
肽酶能够水解疏水性氨基酸和脯氨酸，可用于苦味肽的脱苦，并且通过内肽酶和氨基肽酶的限制性水解的协同作用，还可以降低产品的苦味。中性蛋白酶也广泛用于啤酒和茶饮料等的澄清。中性蛋白酶在茶叶浸出液膜分离中的应用，特别是在红茶中，具有广阔的市场前景。啤酒巴氏杀菌前，加入中性蛋白酶处理啤酒，可以防止啤酒浑浊，延长啤酒贮存时间。此外，中性蛋白酶也可以用来嫩化肉，主要是因为它可以溶解肌原纤维和弹性蛋白，成为不规则的结构。
第二章枯草芽孢杆菌中性蛋白酶npr基因的克隆与表达
2.1简介
中性蛋白酶是枯草芽孢杆菌分泌的主要胞外内肽酶，可用于各种蛋白质水解处理。随着科学技术的飞速发展，以及酶制剂、酶和细胞固定化、酶分子修饰等酶技术的发展，中性蛋白酶的应用范围也在不断扩大。本实验以广州微生物研究所产中性蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌AS1.382为研究对象，提取总脱氧核糖核酸，用聚合酶链反应方法克隆中性蛋白酶基因，并在大肠杆菌中成功表达，获得了具有一定活性的中性蛋白酶，为中性蛋白酶的基因工程提供了理论依据，为该酶的高效表达和应用奠定了基础。
2.2测试材料
2.2.1材料
枯草芽孢杆菌AS1.382:购自广东微生物研究所培养收集中心；基因表达细菌大肠杆菌BL21(DE3):由本实验室保存；克隆宿主菌:大肠杆菌JM109实验室自制克隆载体:北京pGM-T载体天根生化科技有限公司；表达载体:pET-22b(+)储存在这个实验室。
2.2.2主要仪器
各种规格的移液器中国大隆；基因扩增聚合酶链反应系统9600聚合酶链反应扩增产物；日本久保田产品，高速冷冻离心机；-70℃超低温冰箱三洋产品；电泳仪、电泳槽北京61仪器厂；高速台式离心机(TGL 16G)上海医疗分析仪器厂；恒温振荡器(TH2-82)上海跃进医疗器械厂；丹东医疗器械厂恒温水浴箱；上海跃进仪器厂恒温培养箱；4℃冰箱海尔产品；-20℃冰箱海尔产品；凝胶成像分析仪的UVP产品:梅特勒-托利多电子天平仪器有限公司；上海氧化还原仪器厂3C精密酸度计；哈尔滨东联电子技术开发公司洁净工作台；DRP-9272电动恒温培养箱上海沈心实验仪器有限公司；
第三章中性蛋白酶改善大豆分离蛋白的乳化作用..........................................36-48
3.1导言.........................................36
3.2测试材料.........................................36-37
3.3试验方法.........................................37[/比尔/] 3.4结果和分析.........................................37-47
3.5总结和讨论.........................................47-48
第四章乳化大豆分离蛋白提高冰淇淋质量.........................................48-55
4.1导言.........................................48
4.2测试材料.........................................48-49[/溴/] 4.3试验方法.........................................49-51
4.4结果和分析.........................................51-54
4.4.1单因素结果.........................................51-52
4.4.2冰淇淋评价指标的确定.........................................52-54
4.5总结和讨论.........................................54-55
第五章结论和建议.........................................55-56
5.1结论.........................................55
5.2创新点.........................................55
5.3建议.........................................55-56
结论
该实验利用基因工程技术构建了一种产生中性蛋白酶的基因工程菌株。该菌株产生的中性蛋白酶用于修饰大豆分离蛋白。系统研究了改性工艺条件对大豆分离蛋白乳化的影响，并对其在冰淇淋中的应用进行了深入探讨。主要研究结论如下:本实验以枯草芽孢杆菌基因组脱氧核糖核酸为模板。根据nprE基因序列设计和合成引物，通过聚合酶链反应技术扩增获得中性基因，克隆到载体pGM-T中进行酶消化和测序鉴定，将正确鉴定的重组质粒进行酶消化和连接，构建重组表达质粒pET-npr，将重组表达质粒pET-npr转入大肠杆菌BL21(DE3)，成功构建中性蛋白酶产生菌，诱导重组菌表达。中性蛋白酶的酶活性测定为257.63 U/毫升。
以大豆分离蛋白的乳化性能为指标，通过单因素试验确定了酸碱度、大豆分离蛋白质量分数、酶用量、反应温度和反应时间对改性大豆分离蛋白乳化性能的影响，并确定了各因素的最佳范围。在单因素的基础上，利用SAS8.2统计分析软件对试验数据进行处理和分析。同时，所得大豆分离蛋白的最佳改性工艺参数为:pH 7.1，大豆分离蛋白质量分数5.6%，酶用量5000 U/毫升，反应温度51℃，反应时间117分钟。在此条件下，改性大豆分离蛋白的乳化活性为1.390，乳化稳定性为135.67分钟。
两种功能性分别提高了2.125倍和2.146倍。研究了未改性大豆分离蛋白和部分取代奶粉的改性大豆分离蛋白对冰淇淋品质的影响。实验结果表明，当改性大豆分离蛋白的替代率为5%时，冰淇淋的粘度、膨胀率和感官质量最高，而融化率最低。在这种情况下，冰淇淋是最好的。