40000字硕士毕业论文SQS MHGR乌拉尔甘草工程菌及其基因变异体对其表达的影响
论文类型：硕士毕业论文
论文字数：40000字
论点：基因,拷贝,表达
论文概述：
根据分子生物中心法则，拷贝数变异对酶蛋白的活性有影响。因此在次生代谢产物生产过程中，关键酶基因拷贝数变异可通过对生成的关键酶的影响而影响产物生成。本研究发现在含基因不同拷
论文正文：
1文献综述
1.1拷贝数变异体(CNVs)
拷贝数变异体(CNVs)是指基因组中从几kb到几mb范围内的脱氧核糖核酸片段的结构变异，包括:缺失(缺失一个或两个拷贝)、重复(获得一个或多个拷贝)、反转(一个染色体片段的反转)和易位(一个片段从一个染色体转移到另一个染色体)’。拷贝数变异最早是在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Bar基因的研究中发现的，后来认为基因表达可能受到干扰基因和改变基因含量的影响，从而引起表型变化，导致疾病。更令人惊讶的是，拷贝数变异在正常人的基因组中也很丰富。
1.2.1与参考基因组相比，
脱氧核糖核酸片段的拷贝数变异可以使个体之间的脱氧核糖核酸序列差异达到10% \"。Sebat等人通过对20个正常个体基因组的检测，发现了76个具有特异性的CNVs遗传标记，从而发现了70个基因的拷贝数变异多态性；Sharp等人还通过研究7个不同群体(包括47个正常个体)发现了119个多态CNVs遗传标记。
。近年来，巨细胞病毒已成为人类和其他哺乳动物遗传变异研究的热点。随着研究的深入，人们发现巨细胞病毒与许多人类疾病有着非常密切的关系。雷东等人在2006年发布的人类基因组第一代CNVs图谱覆盖了1447个CNVs区域，包括数百个疾病位点等。在关于中枢神经系统病毒(CNVs)与精神分裂症之间相关性的研究ⅰ”中，研究人员发现精神分裂症患者基因组中1号和15号染色体上的拷贝数变异频率很高，这在正常人基因组中很难找到。此外，与单核苷酸多态性不同，大的CNV片段会影响邻近的基因并导致缺陷，从而导致复杂的疾病。例如，中枢神经系统病毒可增加HIV-1感染和肾小球肾炎的风险，并与许多疾病如帕金森病有很强的相关性。在植物研究中，基因拷贝数变异的研究主要集中在利用转基因技术和工程菌外源基因表达技术来改变功能基因的拷贝数，从而提高有效成分的含量。
在代谢途径工程的研究中，通过基因拷贝数变异提高途径化合物产量的应用研究取得了很大进展，主要是利用基因重组技术在基因水平上人工调控产物合成过程。金伍克索(Jin-WookSeo\'i)等通过根癌农杆菌介导增加刺五加角鲨烯合酶基因的拷贝数，从而增加甾醇和三雪产品的产量。孔强剑等人增加了酿酒酵母中HMGR和FPPS基因的拷贝数，从而显著提高了紫穗槐-4，11-二烯在酵母工程菌中的产量。根据中心法则，理论上，拷贝数的增加应该会增加表达产品的产量，但一些研究发现拷贝数的增加有时并不影响产品的产量，有时甚至会产生负面影响。在马斯费勒“3i”等人和贝松比斯等人对转基因拟南芥的研究中，转基因植物存在生长迟缓和过早衰老等现象。然而，李冰等人发现，使用毕赤酵母表达纤维素分解基因时，不同拷贝数的酵母表达参数是不同的，低拷贝重组菌具有相对良好的纤维素分解表达。此外，京沈蓉等人通过构建多拷贝表达盒，利用毕赤酵母表达白细胞介素-10。结果，8拷贝表达盒重组载体的转化体的分泌表达水平最高，这表明拷贝数的增加可以增加目标蛋白的表达水平，但不是线性增加，这可能与基因沉默有关。这些都表明基因拷贝数的变化将对人体、植物甚至宿主细菌产生重大影响。
1.2我实验室甘草酸生物合成途径的研究进展
沈詹韵\" \"和刘东基\" \"对以往甘草酸生物合成途径的研究进行了综述，详见北京中医药大学硕士论文。近年来，研究者在甘草酸生物合成途径中发现了两个与e-香叶醇后续氧化过程相关的新基因，为甘草酸生物合成的进一步研究提供了新的方向。汐宫光·塞基等人2008年的一项研究发现，细胞色素P450单氧化酶基因CYP88D6的表达产物可以催化对香叶醇的碳-11位的氧化。2011年，汐宫光·塞基等人发现细胞色素P450氧化脾基因CYP72A154的表达产物可以催化11-氧化-香叶醇在C-30位的氧化。
2研究思路和方法
2.1研究目的
本项目旨在分别构建具有不同拷贝数的甘草HMGR、SQS和B-AS基因的工程菌，检测它们对基因表达的影响，从基因表达水平揭示功能基因拷贝数变化对Hi的影响，为进一步研究功能基因CNVs对甘草酸含量的影响提供依据，为研究甘草酸含量差异的分子机制奠定基础。
2.2研究内容
2.2.1乌拉尔甘草
HMGR、SQS和IJ-AS基因的毕赤酵母表达载体是以含有乌拉尔甘草HMGR、SQS和β-AS基因的大肠杆菌重组质粒为模板，通过聚合酶链反应获得具有蹄切位点的基因片段，经双重发酵后与表达载体连接，分别构建毕赤酵母表达载体。
2.2.2含有乌拉尔甘草
HMGR、SQS和(J-AS基因)菌株的拷贝数变异筛选将表达载体转化到毕赤酵母中，进行转化体分析、遗传霉素抗性转化体的初步筛选(G418筛选)和Mut+表型筛选。进行诱导表达检测基因的聚合酶链反应快速鉴定和插入，然后提取糖尿病，通过实时荧光定量聚合酶链反应技术准确测定各菌株的拷贝数。
第三章基因工程菌的构建.............................................40-54
3.1实验材料、试剂和仪器.............................................40
3.2准备.............................................40-42
3.3实验方法.............................................42-47
3.4实验结果.............................................47-52
3.5总结和讨论.............................................52-54
第四章实时PCR系统的建立.............................................54-70
4.1实验材料、试剂和仪器.............................................54
4.2实验方法.............................................54-60
4.3实验结果.............................................60-67
4.4总结和讨论.............................................67-70
第五章毕赤酵母基因表达分析.............................................70-80[/溴/] 5.1实验材料、试剂和仪器.............................................70
5.2溶液和培养基制备.............................................70-71
5.3实验方法.............................................71-73[/比尔/] 5.4实验结果.............................................73-79 [/BR/] 5.5结果和讨论.............................................79-80
结论
建立了甘草关键酶基因HMGR、SQS和e-AS的拷贝数变异，并检测了基因拷贝数变异对其表达的影响，为研究甘草酸含量差异的作用机制奠定了基础。
(1)甘草HMGR、SQS和β-AS基因的毕赤酵母表达载体已成功构建用于其他真核表达研究？提供参考；
(2)建立实时聚合酶链反应系统，通过建立标准曲线检测甘草基因插入不同菌株的拷贝数。[/BR/] (3)实现了乌拉尔甘草HMGR、SQS和β-AS基因在毕赤酵母中的拷贝数变异，获得了许多拷贝数不同的乌拉尔甘草基因毕赤酵母菌株。HMGR基因和SQS基因拷贝数多态性广泛分布于乌拉尔甘草三个基因拷贝数变异的检测中。P-AS基因的插入是单拷贝的，没有检测到拷贝数的变化。[/BR/] (4)基因表达的逆转录聚合酶链反应检测结果:HMGR基因表达在插入不同拷贝数时差异显著，插入4个拷贝时表达最高，插入44个拷贝时表达最低，最高为最低的3倍，表明HMGR基因CNVs可能影响其表达。SQS基因插入不同拷贝数时，基因表达无显著差异，表明SQS基因CNVs对其表达无影响。