40000字硕士毕业论文基因工程菌BphAB_LA_4_ 4转化吲哚

论文类型：硕士毕业论文

论文字数：40000字

论点：吲哚,靛蓝,转化

论文概述：

利用不同方法固定基因工程菌BphAB—LA-4，其中海藻酸钠法固定的BphAB_LA>4有最高的转化活性，反应6 h后的靛蓝浓度为9 mg/L;利用两相体系成功避免了反应过程中出现的靛蓝被分解的现象.

论文正文：

1文献综述

1.1吲哚概述
吲哚也称为2，3-苯并吡咯，分子式C8H7N和结构式如图1所示，由五元单环杂环吡咯与苯环融合而成。无色片状晶体广泛存在于动植物中，易溶于乙醇、乙醚、苯和热水。它的化学性质与吡咯相似，而且几乎是碱性的。低浓度吲哚具有淡淡的芳香气味，常用于化妆品、药物、染料和食品添加剂的合成。

1.1.2吲哚
吲哚及其同系物的来源和危害是典型的不可降解氮杂环芳烃污染物，主要来源于烟气、焦化废水和煤矿工业废水。研究表明，这些化合物将对生态环境和人类健康造成巨大危害。例如，油页岩干馏生产合成燃料过程中产生的这些化合物污染了Di的水和地下水。

1.2吲哚转化靛蓝的研究进展
随着微生物资源的逐渐丰富，相关技术手段的不断发展，实验方法的相对成熟，以及科学研究方向的逐步明确，研究者们对吲哚转化靛蓝的研究已经多样化，深入探讨了转化机理，进一步优化了靛蓝的产量，初步探索了吲哚同系物的转化，并进一步考虑了转化技术的使用。在下文中，讨论了反应机理、产率、副产物、同系物和转化过程。

1.2.1基因机制研究
吲哚能在芳香氧化酶羟基化作用下产生靛蓝。不同的氧化酶，不同的羟基化位置和数量，产生不同的转化途径，同时导致靛蓝不同的形成机制。根据羟基化的数量和羟基化产物的结构，我们将吲哚到靛蓝的途径大致分为单氧化途径、双氧化途径和环氧化途径。具体分析如下-(1)在吲哚通过单加氧酶途径转化靛蓝的研究中，已开发出相对多种单加氧酶，包括细胞色素P450单加氧酶、叶黄素单加氧酶、甲苯单加氧酶、木酚氧化酶、苯酚羟化酶等。其中，细胞色素P450酶系统是吲哚转化研究中最彻底的。研究者结合生物信息学、随机突变、定点突变和产物分离鉴定技术，提出了反应途径的详细原理和反应过程中涉及的重要中间产物。1999年，吉兰团队发现异源表达的细胞色素P450s单加氧酶可以产生靛蓝。随后，进一步研究了酶转化靛蓝的行为，分离分析了吲哚转化靛蓝过程中的重要中间产物和副产物，包括3-羟基吲哚、靛红、羟吲哚和靛玉红。阐明了P450s的整个反应过程中所涉及的环节。提出了吲哚美辛转化为靛蓝的经典单氧途径。

2基因工程菌BphAB LA.4的构建及其功能基因的表达

微生物转化比化学转化具有无可比拟的优势。它因绿色、无污染、特异性高、易于控制而广受欢迎。构建转化载体——基因工程菌是体外表达转化相关基因的必要生物转化手段之一。
本章旨在研究:(1)利用分子对接软件分析联苯双加氧酶转化吲哚的可行性；(2)基因工程菌BphAB_LA-4的构建；(3)优化功能基因的表达，包括温度、培养基和诱导剂IPTG的添加量。

2.1材料和方法

2.1.1实验材料
(1)化学试剂本章中使用的化学试剂如表2.1所示。其他化学试剂均为国产分析纯试剂。

2.2结果和讨论

2。2.1分子对接

苯双加氧酶(BphA)是一种芳香族PlH七氧化物，多环芳香族介体，如联苯、多氯联苯、二苯并呋喃等。BPHA RICS KC\' (\'IIII IDLIL:铁NAD(1 >)依赖于加氧酶，包括末端双加氧酶(由hph编码)。u1-11 HPA 2分别代表亚基A和亚基P)、铁还原蛋白(由bphA3编码)和铁还原蛋白还原酶(由6/l44编码)[931。其中，编码亚单位a BphAl对底物的识别和结合起着至关重要的作用。通过分子对接软件，分别用天然底物联苯和底物吲哚模拟BphAl_LA>4。可以直接观察到这两种底物与酶的结合，这为反应的可行性提供了强有力的分析基础。吲哚也可以与铁(ⅱ)结合，铁是酶活性中心的二价铁离子。C2/C3和铁(二)之间的距离是4.7/4.6 A，这与联苯(3.6/4.1 A)没有太大不同。先前的研究表明，底物和铁(ⅱ)之间的距离越近，就越容易与酶结合。因此，吲哚理论上可以成为联苯双加氧酶的底物之一。此外，吲哚吡咯环的氮原子可以与活性中心的氨基酸残基Gln-231和Asp-235形成氢键，使吲哚和酶的结合更加安全。上述结果证实了联苯双加氧酶与吲哚反应的可行性。

3基因工程菌转化吲哚条件的优化..............................36-45
3.1材料和方法..............................36-38
3.1.1实验材料..............................36-37[/比尔/] 3.1.2实验方法..............................37-38
3.2结果和讨论..............................38-43 [/BR/] 3.2.1转化条件的优化..............................38-40
3.2.2转化产品的识别..............................40-42[/比尔/] 3.2.3转化机制的估计..............................42-43
3.3本章总结了..............................结合固定化技术的43-45
4水-有机两相体系..............................45-53
4.1材料和方法..............................45-47
4.1.1实验材料..............................45-46
4.1.2实验方法..............................46-47 [/BR/] 4.2结果和讨论..............................47-52 [/BR/] 4.3本章概述..............................52-53

结论

首先，通过生物信息学方法分析研究的可行性，包括同源建模和靶蛋白的分子对接。然后成功构建了基因工程菌BP hab-la-4。通过对诱导温度、IPTG添加量和培养基的优化，确定了提高休眠细胞活性的最佳诱导条件。用SDS-PAGE分析可溶性蛋白表达与休眠细胞活性提高的关系。在此基础上，进一步研究了转化条件:生物量、吲哚浓度和葡萄糖浓度对吲哚转化为靛蓝的影响。用液相色谱法鉴定了转化产物，分析和推测了BP HAB-LA4休眠细胞转化吲哚的最可能机制。为了改进休眠细胞转化为吲哚美辛的过程，在三种常用的固定化技术中，选择效果最好的海藻酸钠包埋法固定休眠细胞，并结合水-有机两相体系研究吲哚转化为靛蓝。确定了最佳条件，解决了B-吲哚美辛微生物转化过程中靛蓝不易提取、易转化的问题。本文旨在为吲哚转化靛蓝的研究提供新的微生物载体和新的研究思路。得出以下具体结论——吲哚分子的
(1) C2/C3可与BphAl_LA-4活性中心的铁(II)结合，距离为4.7/4.6 A，n-培哚普利分子吡咯环的n原子可与活性中心的氨基酸残基Gln-231和Asp-235形成氢键，使底物和酶的结合更加稳定。
(2)成功构建了基因工程菌BphAB-LA>4。它的静止细胞可以将n-培哚普利转化为靛蓝。SDS-PAGE分析表明，在bphab-la > 4的粗酶沉淀中，大部分蛋白质组分以不溶性蛋白质的形式表达。提高可溶性蛋白表达从而提高静止细胞活性的最佳诱导条件为:诱导温度为15℃，IPTG浓度为0.25 mM，培养基为贫营养培养基M9。在此条件下，吲哚的最高转化率为95%，可溶性蛋白的表达也有所增加，尤其是粗酶上清液中出现较多的大亚基BphAl_LA-4。
(3)BPH al-la-4休眠细胞转化吲哚的最佳条件为生物量0.28克/升，吲哚浓度200毫克/升，葡萄糖浓度0.2%。在此条件下，靛蓝的最高收率为44毫克/升，高效液相色谱-质谱鉴定的转化产物主要包括靛玉红、靛蓝和靛玉红，其中靛蓝是主要产物。推测转化机理是吲哚在双酚a的作用下生成吲哚-2，3-二氢二醇，转化过程中所需的电子由大肠杆菌中的葡萄糖脱乙酰酶和葡萄糖反应连续提供。吲哚-2，3-二氢二醇在BphB和3-？吲哚聚合形成靛玉红。同时，3-羟基毫米自发聚合产生靛蓝。