39100字硕士毕业论文枯草芽孢杆菌高赖氨酸蛋白基因和高蛋氨酸蛋白基因的共表达
论文类型：硕士毕业论文
论文字数：39100字
论点：赖氨酸,氨基酸,芽孢
论文概述：
赖氨酸和蛋氨酸都是动物体内的限制性必需氨基酸，都是畜禽合成动物蛋白必需的重要的氨基酸，畜禽自身不能合成，只能靠外源摄取。赖氨酸是家畜的第一限制性氨基酸，蛋氨酸是家禽中第一
论文正文：
1以前的声明
赖氨酸和蛋氨酸是人类和动物营养需求所必需的两种重要限制性氨基酸，这将影响动物对其他氨基酸的利用率。为了满足动物的需求，促进动物的生长，在饲料中适当添加限制性氨基酸，不仅可以节约蛋白质资源，还可以促进动物的生长，提高饲料的利用率。饲料中添加的氨基酸主要来自微生物发酵和化学合成。氨基酸的化学合成生产工艺相对复杂，产生许多副产物，不能直接添加，而且价格昂贵。通常，微生物发酵产生的氨基酸的生物效率高于化学合成产生的氨基酸。此外，益生菌生产的氨基酸绿色、无毒、无污染、安全可靠。因此，发酵益生菌(发酵液中包含的赖氨酸和蛋氨酸)可以作为饲料添加剂直接添加到饲料中。
1.1赖氨酸在畜牧业中的应用
赖氨酸也称为左旋赖氨酸盐酸盐，其化学名称为:2，6-二氨基己酸或α，ε-二氨基己酸；英文名是里斯；ine，缩写为Lys化学结构式为:h2n CH2CH 2CH2CH 2CH(NH2)COOH(NH2)COOH，相对分子量为182.65。赖氨酸是人类和动物营养需要的9种必需氨基酸中的第一种必需氨基酸。赖氨酸有三种外消旋异构体:左旋、右旋和右旋。只有L型能被人和动物吸收和利用。赖氨酸是人类和动物不能合成的必需氨基酸之一。它广泛用于饲料添加剂、食品增强剂和药品，90%以上的赖氨酸产品用作饲料添加剂[1】。左旋赖氨酸盐是赖氨酸的左旋光学异构体；外观为白色或浅棕色结晶粉末，无味或稍有特殊气味，溶于水，不溶于乙醇和乙醚，光学活性，熔点263 ~ 264℃，中国已制定饲料添加剂盐酸赖氨酸国家标准(GB 8245 ~ 87)。
1.1.1赖氨酸的微生物合成
目前，赖氨酸的主要生物合成途径是微生物发酵，这是世界上生产赖氨酸的主要方法，年产量超过100万吨。微生物发酵法可分为两种:添加前体发酵法和直接发酵法。赖氨酸生物合成有两种完全不同的途径:二氨基庚二酸途径(即添加前体发酵法)和α-氨基己二酸途径(即直接发酵法)，它们分别由不同的酶调节以控制赖氨酸的合成。(1)二氨基庚酸途径(DAP Pathway):二氨基庚酸途径，也称为天冬氨酸途径，是从天冬氨酸开始通过二氨基庚酸的代谢途径。细菌、原生动物、一些真菌、一些藻类和高等植物通过这种途径生产赖氨酸。细菌的赖氨酸生物合成途径如图1-1所示。
1.1.2赖氨酸作为饲料添加剂的功效
赖氨酸是植物饲料(豆粕除外)中最缺乏的氨基酸。事实证明，向饲料中直接添加赖氨酸非常有用，它不会导致超出其需求的其他氨基酸的额外吸收和代谢，并且它可以避免过量氨的形成和肥料[3]中氮含量增加引起的环境负担。在现代畜牧业和饲料工业中，工业赖氨酸占有非常重要的地位。毫不夸张地说，没有工业赖氨酸，现代畜牧业是不可想象的。工业赖氨酸至少起以下作用:(1)改善饲料氨基酸平衡，促进动物生长发育:在生长期，动物细胞增殖旺盛，尤其需要蛋白质作为身体发育的原料。实践证明，在饲料中添加适量的赖氨酸和蛋氨酸可以增加动物体内蛋白质的合成，从而促进动物的生长发育。曾培林等人(2009)表明，在20~35g生长猪的日粮中添加赖氨酸可以显著提高猪血清中丝氨酸、谷氨酸等多种氨基酸的含量，从而促进猪的生长发育[4]。(2)改善肉质，增加产奶量和产蛋量:在饲料中添加赖氨酸可以使猪的胴体外观好、肉质鲜嫩、皮薄、瘦肉率高。当每天在饲料中添加30g蛋氨酸饲喂奶牛时，每头奶牛每天可以多产1.5~1.6kg牛奶，这对老奶牛更为显著。(3)节约蛋白质饲料，充分利用饲料:有时，饲料可能含有比动物实际需要更多的蛋白质，从而造成蛋白质浪费和氨基酸失衡。如果在饲料中添加适当的蛋氨酸和赖氨酸，可以纠正氨基酸的平衡，提高蛋白质的利用率，达到节约高价蛋白质的效果。实践证明，1吨蛋氨酸可以节约100吨饲料，相当于20000m2饲料用地的经济效益。1吨赖氨酸可节省饲料125吨，可生产10 ~ 16吨猪肉或8吨鸡肉，或25万个蛋。(4)降低成本，提高饲料利用率。此外，氨基酸添加剂还具有用量小、效率高、易储存、使用安全、无副作用等特点。
2材料和方法
2.1材料
2.1.1实验材料
原料:辣椒花药(来自东北农业大学农场)；玉米种子(农大108)保存在这个实验室。菌株:大肠杆菌10，购自大连宝生物技术有限公司；野生型枯草芽孢杆菌)168保存在该实验室。质粒载体:pMD18-T载体，购自大连宝生物技术有限公司(图1-1)；枯草芽孢杆菌表达载体pHT43购自德国分子生物技术公司(图1-2)。
2.1.2培养基
LB液体培养基:1%类型；0.5%酵母提取物；1%氯化钠；酸碱度7.0 ~ 7.4；配制固体培养基时，应加入1.5%琼脂，在115℃灭菌20min。培养基:牛肉膏5g、酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、葡萄糖5g、蒸馏水1000毫升、pH7.5. 1×最小盐溶液:k2hpo414g (k2hpo43h2o18.34g)、kh2po 46g(NH4)2So 42g、1g柠檬酸钠(na3c6h5o72h2o)和0.2g mgso47h2o，依次溶于蒸馏水中，加水至1000毫升。L-trp溶液:2mg/mL，储存在棕色瓶中，用黑纸包裹。生长培养基:通用汽车，使用时混合比例。最低盐溶液1×100毫升，1M硫酸镁0.5毫升，50%葡萄糖1毫升，5%水解酪蛋白0.4毫升，10%酵母汁1毫升，左旋色氨酸50微克/毫升。转化介质:TM，使用时的混合比。1×100毫升最低盐溶液、0.5毫升1M硫酸镁、1毫升50%葡萄糖、0.2毫升5%水解酪蛋白和5微克/毫升左旋色氨酸。
2.1.3实验药物
三唑试剂购自Invitrogen公司；反向转移酶M-MLV(核糖核酸酶H-)、克隆核糖核酸酶抑制剂、脱氧核糖核酸酶混合物(10uM和2.5uM)、寡聚脱氧核糖核酸(T)15引物、Ex Taq酶、T4DNA连接酶、脱氧核糖核酸标记、Xbaⅰⅰⅰ和Smaⅰⅰⅰ限制性内切酶和蛋白质标记均购自大连宝生物技术有限公司；氨苄西林、氯霉素和异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)购自上海生物工程公司。赖氨酸标准品和1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)均购自西格玛；。DL-蛋氨酸标准品(色谱纯)购自天津精细化学品回收研究所。DL-甲硫氨酸砜标准品购自阿尔法·爱萨；；琼脂糖凝胶脱氧核糖核酸回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自安盛公司。引物由北京帅公司合成。其他试剂均为进口或国产纯分析试剂。
3结果和分析...29
3.1基因扩增...29
3.1.1高赖氨酸蛋白基因Cflr扩增...29
3.1.2高蛋氨酸蛋白基因玉米醇溶蛋白扩增...31
3.2枯草芽孢杆菌表达载体pHT43/ Cflr.........34
3.2.1枯草芽孢杆菌表达载体pHT43/Cflr的构建......34
3.2.2枯草芽孢杆菌表达载体pHT43/玉米醇溶蛋白的构建........34
3.3枯草芽孢杆菌表达载体pHT43/ Cflr的构建.........36
3.3.1枯草芽孢杆菌表达载体pHT43/Cflr的转化........36[/比尔/] 3.3.2枯草芽孢杆菌表达载体pHT43/玉米醇溶蛋白的转化........36[/比尔/] 3.3.3重组质粒pHT43/Cflr和pHT43/玉米醇溶蛋白的稳定性.........38
3.4 pHt43/玉米醇溶蛋白在mRNA水平上的表达.........38
蛋白水平上p43/玉米醇溶蛋白的3.5表达........39
3.6赖氨酸的高效液相色谱检测........40
4讨论...44
4.1RNA提取...44
4.2基因克隆...45
4.3表达载体构建...46
4.4枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备.......47
4.5埃普汀诱导枯草芽孢杆菌靶基因表达.........48
4.6重组枯草芽孢杆菌赖氨酸和蛋氨酸含量的测定.......48
4.7重组枯草芽孢杆菌.........49
5结论.......51
结论
高赖氨酸蛋白基因Cflr的所有编码区均通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)克隆，720bp片段通过Blast分析与NCBI序列(基因登录号:EU367999)确认为Cflr基因序列，同源性为99%。用逆转录聚合酶链反应克隆了蛋氨酸含量高的玉米醇溶蛋白基因的所有编码区。用NCBI序列(基因登录号:541922dzs10)进行Blast分析，证实该476bp片段为玉米醇溶蛋白基因序列。
本研究成功构建了枯草芽孢杆菌表达载体pHT43/Cflr和pHT43/玉米醇溶蛋白，并将这两种表达载体成功转入枯草芽孢杆菌中并相继表达。快速定量聚合酶链反应结果表明，高赖氨酸蛋白基因和高蛋氨酸蛋白基因均在基因水平表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，蛋白质条带分别出现在24kD和16kD，与靶蛋白的大小一致。
重组菌和野生菌发酵后，用高效液相色谱法测定发酵液中赖氨酸和蛋氨酸的含量。与野生菌相比，重组菌发酵液中赖氨酸含量增加了16.05%(n=5)，蛋氨酸含量增加了24.94%(n=5)。
参考
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