38120字硕士毕业论文DH5α upp基因在大肠杆菌中的敲除及应用

论文类型：硕士毕业论文

论文字数：38120字

论点：同源,重组,模型

论文概述：

本文欲利用Red同源重组系统对大肠杆菌基因组进行改造，敲除染色体上的upp基因。使用的Red重组酶表达载体为Datsenko等构建的plCD46质粒，如图1.8所示，Red重组系统的三个基因g膽、bet、exo位于强启

论文正文：

介绍

1.1同源重组
在生物进化过程中，不同个体之间的基因交换和体内同一基因组的遗传重组可以在短时间内快速产生各种基因型个体，并广泛参与自然选择的竞争，从而使群体的遗传基础在进化中不断积累优秀基因，不断淘汰不利基因。从这个意义上说，我们可以认为生物学中的每个个体都是基因重组体。这种重组技术包括同源重组、位点特异性重组、非同源重组和转位重组等。(1)。同源重组，也称为一般重组，是染色体间交换遗传信息的方式之一。这种重组几乎发生在所有生物中，例如真核生物中的姐妹染色单体交换。细菌和一些低等真核生物的转化；细菌的转导和接合属于同源重组。此外，同源重组经常发生在受损细胞中，这是修复受损细胞的重要途径。同源重组技术是分子生物学实验中常用的技术手段，在基因克隆和基因敲除中有着广泛的应用。

1.1.1同源重组的分子模型
目前同源重组过程有三种被广泛接受的模型，即霍利迪双链入侵模型、单链入侵模型(迈森-拉丁模型)和双链断裂修复模型(绍斯塔克模型)[2]。1.霍利迪双链入侵模型1964年，霍利迪在研究真菌基因转化的遗传机制时首次提出了异源双链交叉结构模型，又称霍利迪模型。该模型的两个关键点是重组过程中脱氧核糖核酸链的断裂和重新连接，以及霍利迪接头结构的形成。然而，霍利迪模型中没有基因复制。电镜观察和分子生物学研究证明霍利迪接头结构确实存在于重组过程中。霍利迪结构也是其他型号中常见的重组毛巾本体。霍利迪双链入侵模型已被广泛接受为标准模型。然而，这个模型的一个问题是，两个脱氧核糖核酸分子必须同时在几乎相同的位置被切断，才能引起重组，这在生物体中不太可能发生[2]。其次，单链入侵模型(Meselson-Radding model)单链入侵模型是由Meselson和adding于1975年提出的。在这个模型中，他们对霍利迪模型做了一些补充和修改。单链入侵模型的解释是，两个脱氧核糖核酸分子中的一个单链在随机位置被切断，然后暴露的末端入侵另一个双链脱氧核糖核酸分子，直到找到其互补序列。如果它找到这样的序列，它将取代它原来的链，然后脱氧核糖核酸聚合酶将使用留下的链作为模板来填补入侵链留下的缺口。取代的链将被降解，其剩余的末端将连接到另一个分子中新合成的脱氧核糖核酸链上，形成霍利迪接头。一旦霍利迪链接器形成，它将像霍利迪模型一样异构化，然后分裂。在这种模型毛巾中，可以产生不对称异源双链体。3.双链断裂修复模型(Szostak模型。)1983年，绍斯塔克在研究酿酒酵母的遗传重组后，提出了双链断裂修复模型。绍斯塔克模型的解释是:参与重组的一对脱氧核糖核酸首先分裂了吗？链断裂的原因之一可以是核酸内切酶断裂或其他因素引起的双链断裂，然后在核酸外切酶的作用下被扩增成缺口，并在一种或多种核酸内切酶的作用下产生3’单链突出的粘性末端。两个游离3’端中的一个侵入另一个双链脱氧核糖核酸的同源区域，取代供体双链脱氧核糖核酸的一个单链形成双链脱氧核糖核酸，并产生一个D环。脱氧核糖核酸聚合酶以3’端为引物，解锁的单链脱氧核糖核酸为复制和修复模板，最终形成两个霍利迪接头。最后，两个霍利迪连接器像前两个模型一样被拆分。总之，原核生物和真核生物的遗传重组模型主要是以上三种类型。这三种模式实际上是相互关联和互补的。越来越多的研究证明双链断裂引起的同源重组更加普遍。

1.2重链重组系统
重链重组系统是大肠杆菌自身携带的非外源性重组系统，主要由重链蛋白和重链复合蛋白组成。RecA蛋白可以促进同源基因分子之间的同源关联、配对、链交换和分支迁移。它是重组过程中最重要的蛋白RecA蛋白。它有两个主要特征:(1)单链脱氧核糖核酸结合活性:重链脱氧核糖核酸(RecA)蛋白能大量结合单链脱氧核糖核酸，平均重链脱氧核糖核酸(RecA)单体能结合4个核苷酸，这需要三磷酸腺苷(ATP)；(2)三磷酸腺苷依赖性酶活性:重钙蛋白能在脱氧核糖核酸存在下水解三磷酸腺苷，从而促进链交换。研究表明，RecA蛋白催化的同源配对和链交换过程可分为三个阶段:预缔合，即RecA蛋白聚集在单链脱氧核糖核酸上，通过RecBCD酶的作用产生3’末端突出端，形成核酸蛋白丝状复合物；(2)突触，即突触完成后，RecA蛋白启动与其结合的单链脱氧核糖核酸寻找同源双链脱氧核糖核酸，并使单链脱氧核糖核酸和双链脱氧核糖核酸纵向配对，形成RecA-单链脱氧核糖核酸的三元复合物；(3)链交换，即单链脱氧核糖核酸在完成同源配对后侵入双链脱氧核糖核酸毛巾替换同源部分，单链脱氧核糖核酸与互补链进行碱基配对，然后形成D环。

2短同源臂介导的大肠杆菌基因敲除

2.1材料和仪器
在过夜的脱氧核糖核酸转化后，单个菌落生长。选择几个单个菌落并放入含有氨苄青霉素10(Vg/rnL)的LB液体试管中。过夜培养后，提取质粒以验证质粒是否转化到大肠杆菌细胞中。用碱裂解法提取少量质粒DNA:(1)用1.5mL过夜培养的细菌溶液，弃去上清液收集细菌细胞；(2)向离心管中加入100(ILsⅰ)，用移液管枪吹，以悬浮细菌的重量；(3)加入200个细胞裂解物811，轻轻地上下颠倒离心管几次，直到溶液变得透明和粘稠，过程不应超过5分钟；(4)加入150 SIII，将离心管倒置约10次，离心管毛巾会出现白色絮状沉淀，将离心管放入-2(rC毛巾静置5min(5)在室温下以12000转/分钟离心5分钟(或5min -2(rC静置5分钟，直接12000转/分钟，4℃低温离心10分钟)，小心地将上清液吸入另一个干净的离心管中；(6)加入等体积的苯酚氯仿，在涡旋混合器上振荡5秒钟，以12000转/分的速度离心Imin，小心地将上层水相转移到新的干净离心管中；(7)重复操作(6)一次；(8)增加2？将2.5倍体积的无水乙醇摇动并在涡旋混合器中混合，然后放入-2(rC)冰箱毛巾中约20分钟；(9)20分钟后，以12000转/分的速度取出离心管，在4℃离心5分钟，用70%乙醇洗涤白色沉淀两次，然后逆流自然干燥沉淀。(10)加入20-30l ddhso溶解沉淀。提取质粒并储存在-20℃下

3长同源臂介导的大肠杆菌基因敲除……25
3.1实验材料.........25
3.1.1菌株和质粒.........25
3.1.2主要工具酶和化学试剂.........25
3.1.3引物合成.........25[/溴/] 3.1.4培养基和缓冲液的制备.........25[/比尔/] 3.2实验方法.........25[/比尔/] 3.3实验结果.........27[/比尔/] 3.3.1重叠延伸结果的验证.........27[/比尔/] 3.3.2 upp敲除聚合酶链反应验证.........29
3.4讨论.........29
4 DH5α UPP应用.........31
4.1实验材料.........31
4.2实验方法.........32
4.3实验结果.........37
4.4讨论.........44
5结论.........46

结论

1。本研究利用红色同源重组技术，从分子水平对常见大肠杆菌DH5a进行了修饰，获得了upp基因敲除菌株DH5a -Auppo。使用了两种敲除方法。参照Datsenko等人的基因敲除策略，用H50bp长的同源臂作为引物合成基因？将线性线段分组。二是通过上游和下游同源臂的重叠延伸聚合酶链反应融合克隆基因重组线性片段，利用丽珠upp基因本身作为反向筛选标记，达到敲除的筛选目的。结果表明，长同源臂的敲除效率高于短同源臂。
2。DH5a -Aupp成功地用作非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶阳性和阴性筛选系统的宿主细菌。碘信息素试验结果表明，DH5a能够满足筛选系统的要求，为进一步筛选其他非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶积累了一定的基础。

参考
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