论文范文核糖核酸干扰文库的分析及其在功能基因组学研究中的应用
论文类型：论文范文
论文字数：
论点：基因,文库,细胞
论文概述：
这篇论文主要从哺乳动物细胞已知基因RNAi文库等几个方面做了详细的介绍，提出RNA干扰文库拥有广泛的前景。本论文由硕博论文网生物论文频道提供。
论文正文：
引言:本文主要从哺乳动物细胞中已知基因的RNAi文库等几个方面进行了详细介绍，指出RNAi干扰文库具有广阔的前景。本论文由硕博论文网生物论文频道提供。
核糖核酸干扰文库的分析和核糖核酸干扰文库在功能基因组学研究中的应用
人类基因组大规模测序已经基本完成。然而，对基因组序列的解码只是一个起点，目前大多数基因的功能还不清楚，因此对基因功能的研究是未来的发展趋势。研究基因功能最有效的传统技术之一是细胞和小鼠的基因敲除。然而，该技术存在工艺复杂、周期长、成本高等缺点，极大地限制了其应用。物理和化学突变技术的应用可以诱导基因的随机突变，造成细胞或动物的表型缺陷，并直接筛选基因功能。然而，由于这种方法通常需要同时突变两个等位基因来产生明显的表型，所以成功的机会相对较低。然而，核糖核酸干扰(RNAi)文库有望成为功能基因组学研究的简单、高效、大规模和高通量工具。
RNAi和RNAi文库
RNAi是近年来的重要发现，是动植物中常见的防御反应。核糖核酸被细胞中出现的双链核糖核酸激活，这种双链核糖核酸可以高度特异性地抑制同源基因的表达。根据目前的研究，核糖核酸的可能机制如下:长片段脱氧核糖核酸被细胞内的第三型核糖核酸酶Dicer切割成长度约为19-23 nt的小干扰核糖核酸(siRNA)，siRNA参与形成复合RISC(核糖核酸诱导的沉默复合物)。SiRNA导致RISC通过与同源基因的特异性配对特异性降解同源基因，从而抑制基因表达。因此，小的siRNA片段也能诱导有效的基因沉默。
在线蠕虫、dsRNA的注射或喂养可导致动物各种器官中特定基因的沉默，这种抑制作用可持续到第一代后代动物。然而，在哺乳动物细胞中，直接转染dsRNA的长片段会引起细胞的毒性反应，导致较差的基因沉默效果。近年来，有报道称通过使用体外合成的siRNA或用载体如质粒和病毒在细胞中表达siRNA来抑制特定基因在细胞和小鼠中的表达。
RNAi文库是人工构建的杂交文库，通过诱导RNAi可以抑制许多不同基因的表达。它可用于建立功能丧失的生物或细胞文库和筛选表型。这项技术的应用是最成功的。在线虫等模式生物的研究中，RNAi文库被用于建立被随机基因抑制的线虫，并进行表型筛选。在胚胎发育等地方已经有了重要的发现。该文库使用含有两个方向相反的T7启动子的载体，分别从随机克隆的cDNA模板转录有义和反义核酸的长片段，形成dsRNA，由Dicer在体内切割成siRNA的小片段，特异性抑制靶基因的表达。由于胞外dsRNA不能有效诱导哺乳动物细胞中的RNAi，长链dsRNA(>30nt)可导致哺乳动物细胞的毒性反应和非特异性细胞生长停滞和凋亡，上述转录长链dsRNA以建立RNAi文库的方法不能应用于哺乳动物及其细胞。
线虫和人类等模式生物之间有很大的差距。尽管从模型生物中获得的研究结果意义重大，但它们不能取代对人类和其他高等动物的直接研究。因此，建立可用于人类细胞和其他哺乳动物细胞的RNAi文库具有重要意义。RNAi文库将为研究基因功能、寻找新的药物靶基因、寻找疾病相关基因、探索肿瘤治疗的新途径等提供重要的方法。到目前为止，在哺乳动物细胞中建立RNAi文库的方法有两种。我们将介绍这两种类型的文库构建方案及其在功能基因组学研究中的应用。
哺乳动物细胞中已知基因的RNAi文库
哺乳动物细胞中已知基因的RNAi文库的构建方法如下:首先选择目标基因，根据目标基因的脱氧核糖核酸序列和siRNA设计原则合成siRNA，或者合成寡核苷酸序列并克隆到表达载体中，或者通过聚合酶链反应扩增siRNA表达盒。许多针对不同基因的siRNA或siRNA表达载体或表达盒构成了有限的RNAi文库。用该文库转染的哺乳动物细胞可特异性抑制不同基因的表达，功能基因可通过表型筛选找到，如筛选信号转导途径的新分子、筛选与肿瘤细胞存活或转移相关的基因等。
Aza-Blanc等人利用达尔曼公司生产的510个基因(包括大多数激酶基因)的siRNA文库，通过转染HeLa细胞筛选调控TRAIL诱导的细细胞凋亡的基因。肿瘤坏死因子相关凋亡配体是肿瘤坏死因子家族的成员，具有抗肿瘤作用。实验证明，TRAIL蛋白能与DR4和DR5受体结合，诱导多种肿瘤细胞凋亡，而不影响正常细胞。Aza-Blanc等人的筛选发现了一些能够增强TRAIL诱导的凋亡的基因，也发现了一些具有抑制作用的基因。这些基因包括以前已知的调节肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)功能的基因，如GSK30α和SRP72，以及未知的调节基因，如DOBI和MIRSA，这对理解肿瘤坏死因子相关凋亡配体的机制和开发抗肿瘤药物具有重要意义。
Berns等人为7914个基因构建了人类RNAi文库。他们应用了shRNA逆转录病毒载体，每个基因构建了3个不同的SHRNA载体，总共23，742个不同的载体。RNAi文库用于筛选基因功能，发现一个已知和五个未知基因在p53依赖性增殖延迟中起调节作用。进一步的研究已经证明，抑制这些基因的表达导致依赖p53和p19ARF的细胞增殖停滞，并且由脱氧核糖核酸损伤诱导的细胞周期停滞不敏感。Paddison等人利用shRNA病毒载体构建了靶向9610个人类基因和5563个小鼠基因的shRNA表达文库。在26S蛋白酶系统功能基因的筛选中，证实了RNAi文库的实用性和可靠性。
Zheng等人构建了双启动子载体pDual。载体包含两个相反方向的聚合酶ⅲ启动子，即小鼠U6启动子和人H1启动子，中间插入一个能够转录siRNA的脱氧核糖核酸序列(图1)。本发明的有益效果是:有义和反义核酸由同一序列转录而来，缩短了合成的序列长度，降低了成本和工作量。他们巧妙地设计了一个带有双启动子的siRNA表达盒，可通过聚合酶链反应扩增，并证明它能有效抑制哺乳动物细胞中的基因表达。利用这一技术，他们构建了靶向8000个基因的siRNA表达盒，并在大规模功能基因筛选中发现了一些已知和未知基因，这些基因在NF-KB信号转导途径中起着重要作用。
Silva等人将siRNA和siRNA表达载体与转染剂混合，然后以微阵列的形式将它们点在细胞培养板上，微阵列可以转染生长在板上并与它们接触的活细胞。该技术为利用RNAi文库筛选细胞基因功能提供了一种简单有效的方法。
上述研究证明了有限的已知基因RNAi文库在哺乳动物细胞基因功能研究中的可行性，为哺乳动物及其细胞的大规模功能基因组学研究提供了重要技术。
已知基因RNAi文库有以下缺陷:a .它不是随机的RNAi文库，靶基因的序列必须是已知的，细胞基因的覆盖范围窄；b每个基因必须合成2个以上的寡核苷酸，以确保更好的干扰效果。需要合成许多不同的siRNA或构建许多不同的载体；成本高，筛选工作量大。
3哺乳动物细胞随机核糖核酸文库
随机核糖核酸文库是一种人工构建的核糖核酸文库，可以靶向任何基因。目前有两种报道方法，一种是通过化学合成随机的脱氧核糖核酸序列，另一种是通过脱氧核糖核酸酶消化并克隆到载体上。随机RNAi文库不需要知道目标基因的序列，因此理论上可以形成抑制任何基因表达的干扰文库，克服已知基因RNAi文库在细胞中基因覆盖窄的缺陷。像普通的基因表达文库一样，该文库是不同siRNA载体的混合物，因此易于储存并显著减少筛选工作量。
化学合成随机脱氧核糖核酸序列以形成随机核糖核酸文库的方法应用以下原则。在寡核苷酸的化学合成中，如果碱基是氮，则在合成脱氧核糖核酸片段时，脱氧核糖核酸合成器将随机选择甲、丁、庚、丙中的任何一种。如果选择19至21 nt的寡核苷酸中的一些或全部作为n，则形成具有不同随机序列的许多寡核苷酸的混合物。互补链合成并克隆到双启动子RNAi载体(见图1的载体)后，形成随机RNAi文库。
限制性内切酶Mme的特征在于在一个脱氧核糖核酸识别序列下游20-21 bp切割一个脱氧核糖核酸片段。罗等人巧妙地应用了Mme的独特特性，设计了一个名为SPEED的方案，将长的cDNA片段酶切成20~2l nt的小片段，克隆到siRNA表达载体中，形成随机的RNAi文库。首先，将随机的cDNA片段与含有Mmeⅰ切割位点发夹结构的脱氧核糖核酸接头连接，然后被Mmeⅰ消化，得到与接头连接的20-21 bp的cDNA小片段。将形成的双链脱氧核糖核酸打开成单链，合成互补链，形成两个方向相反的小脱氧核糖核酸片段的拷贝，其中中间是形成发夹结构的不成对脱氧核糖核酸序列。然后克隆到逆转录病毒载体中，形成随机RNAi文库。利用小鼠胚胎cDNA文库，建立了含有3×106个克隆的随机RNAi文库，可以抑制许多不同的基因，证明了该方法的可行性。
Shirane等人独立设计了构建随机RNAi文库的方法，称为EPRIL，采用与Loo等人相同的思路，利用鼠FL5.12细胞的cDNA文库，他们建立了随机RNAi文库。对240个不同克隆的随机测序表明，215个克隆含有能够表达siRNA的正确的脱氧核糖核酸片段。BLAST分析表明，165个克隆的插入片段与已知基因或EST序列一致，其中大部分属于不同的基因。这一结果表明EPRIL可用于构建复杂基因的随机RNAi文库。
Sen等人独立设计了一个类似的数据库构建方案，称为REGS(限制性内切酶生成的SiRNA)。为了测试这项技术的效果，他们测试了转基因和内源基因的效果。实验表明，该技术制备的RNAi文库能有效抑制绿色荧光蛋白、OCT-3/4和MyoD的表达。他们用这种方法构建了一个随机的RNAi文库，其中含有4×105个来自混合cDNA的克隆。
虽然RNAi文库的构建和应用还存在一些有待克服的问题，但该技术在大规模基因功能筛选和研究中显示了广阔的应用前景。它的成功应用有望极大地促进基因功能的研究。