40000字硕士毕业论文我国乳酸菌传统发酵食品的耐药性及功能菌株研究

论文类型：硕士毕业论文

论文字数：40000字

论点：乳酸菌,耐药,发酵

论文概述：

本论文初步对中国传统发酵食品中乳酸菌的种属和功能的多样性进行了分析，实验证明了发酵食品中的乳酸菌有的对健康有益，也有的存在食品安全隐患。研究结论为中国发酵食品安全评价和发

论文正文：

第一章导言

1.1乳酸菌和发酵食品
发酵食品是指由微生物或酶加工的食品，如奶酪、发酵香肠、泡菜等。我国传统发酵食品种类繁多，微生物种类丰富，其中乳酸菌是最重要的微生物类群。
乳酸菌是一组能够利用可发酵糖、产生大量乳酸且无孢子的革兰氏阳性菌。它们包括乳球菌、乳杆菌、肠球菌、明串珠菌、链球菌、双歧杆菌和属于许多属的其他细菌。乳酸菌在发酵食品的生产中起着极其重要的作用。首先，在发酵过程中，乳酸菌可以迅速产生有机酸、乙醇等。并且许多乳酸菌可以合成具有抗菌作用的细菌素，这对抑制致病菌和腐败菌具有重要意义。其次，乳酸菌能产生一系列重要的酶[2-4]，促进食品原料的快速利用，乳酸菌能合成许多芳香物质，在食品风味的形成中起着关键作用。此外，乳酸菌还能产生多种其他功能成分，如γ-氨基丁酸、胞外多糖等。，有效改善发酵食品的营养功能或改善食品的质地[1】。长期以来，发酵食品中长期使用的乳酸菌被认为是安全的，但是最近的研究发现，一些乳酸菌也具有耐药性，一些乳酸菌具有可转移的耐药性，这很可能导致食品安全问题。因此，评价乳酸菌菌株的安全性已成为近年来国际研究的热点。中国发酵食品居世界第一，尤其是中国传统发酵食品品种繁多，是食品工业和国民经济的重要组成部分。在中国，自然接种主要用于传统发酵食品的生产。其次，环境和原料中的乳酸菌影响发酵食品的安全性和功能性。在保证乳酸菌安全性的前提下，筛选高产功能物质的乳酸菌具有重要的应用前景。因此，分别综述了乳酸菌耐药性、γ-氨基丁酸和胞外多糖的研究进展。

1.2乳酸菌及其耐药性

1.2.1抗生素与微生物的耐药机制
抗生素是由具有抗菌或杀菌功能的微生物产生的一类次生代谢产物。尽管抗生素的应用对人类疾病的治疗做出了巨大贡献，但由于抗生素的过度使用和误用，环境微生物面临着选择抗生素的压力，这导致了各种耐药微生物的出现，给疾病的治疗带来了挑战。微生物的耐药机制大致可分为四种类型:
(1)因基因突变或相应修饰酶的产生而导致的抗生素靶标的变化；
(2)细胞结构的变化，如细胞膜通透性的变化，阻止药物进入细胞；
(3)生产修饰或降解抗生素以禁用抗生素的酶；
(4)通过药物泵[5-7将抗生素转移到细胞外。细菌的抗生素耐药性大致可分为两种类型:内在耐药性和获得性耐药性。固有耐药性一般不会转移，例如，大多数乳酸菌对革兰氏阴性菌具有固有耐药性
第二章实验材料和方法........................................................17-28
2.1实验材料........................................................17-20[/比尔/] 2.1.1中等........................................................17[/溴/] 2.1.2菌株，载体，引物........................................................17-18
2.1.3工具酶、试剂和试剂盒........................................................18-19
2.1.4发酵食品和来源........................................................19
2.1.5主要文书........................................................19-20
2.2分子生物学和微生物学的基本操作........................................................20-22
第三章结果和讨论........................................................28-43[/溴/] 3.1食品中乳酸菌耐药性的初步研究........................................................28-35
3.1.1发酵食品中耐药乳酸菌比例统计........................................................28-29
3.1.2多药耐药乳酸菌呈现多药耐药性........................................................29-31
3.2食品中产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选........................................................35-39
3.3食品中产胞外多糖乳酸菌的筛选........................................................39-43
第四章结论与展望........................................................43-45
4.1结论........................................................43
4 . 1 . 1 11种食品中乳酸菌的耐药性分析........................................................43
4.1.2食品中产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选........................................................43
4.1.3食品中高产胞外多糖乳酸菌的筛选........................................................43
4.2前景........................................................43-45。
获得性耐药性主要是由抗生素的选择性压力造成的。耐药基因可以通过自身基因的突变产生，也可以从外界获得，这就有可能在细菌之间水平转移。耐药性可以通过接合、转化和转导来转移
结论。许多可转移的耐药基因位于质粒或转座子等活性移动元件上，接合可以跨物种边界转移脱氧核糖核酸，使接合成为耐药水平传播的主要方式。

第二章实验材料和方法

2.1实验材料
MRS培养基:1 %(w/v，下同)蛋白胨、0.5%酵母提取物、1 %牛肉提取物、2%葡萄糖、0.3%无水乙酸钠、0.2%柠檬酸三铵、0.2%磷酸二氢钾、0.01%无水硫酸镁、0.025%一水合硫酸锰、0.1%吐温80、pH 6.8。PYG培养基:在Mrs SDM培养基[81的基础上加入1%谷氨酸钠:1%细菌蛋白胨，0.5%酵母氮源，2%乳糖，0.5%无水乙酸钠，0.2%柠檬酸三铵，0.2%磷酸二氢钾，0.01%七水硫酸镁，0.05%硫酸锰，0.1%吐温80，pH 6.8。LSM培养基:90%为等敏(OXOID)，10%为MRS，混合后使用。ALSM培养基:在LSM的基础上，加入以下浓度的抗生素:四环素0.25-512毫克/升，红霉素1-512毫克/升，卡那霉素1-2048毫克/升，氯霉素0.25-64毫克/升，环丙沙星0.5-64毫克/升，克林霉素0.5-128毫克/升，氨苄西林0.25-64毫克/升..LBN培养基:在LSM的基础上加入0.02%溴甲酚紫指示剂和50毫克/升制霉菌素。ALBN培养基:在LBN培养基的基础上添加一定浓度的抗生素，抗生素的添加量根据EFSA标准中乳酸菌种的最高断点选择如下:氯霉素8毫克/升，卡那霉素512毫克/升，四环素32毫克/升，环丙沙星4毫克/升，氨苄西林钠4毫克/升，克林霉素4毫克/升，红霉素4毫克/升..LB培养基:1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化钠，pH 7.0。TSB培养基:从美国BD公司购买。BHI培养基:从Biosharp公司购买的上述培养基制备固体培养基时，应添加1.5%琼脂粉。

2.1.2菌株、载体、
引物菌株:大肠杆菌JM109、金黄色葡萄球菌ATCC25923、李斯特菌单胞菌NB、干酪乳杆菌LPC-37、乳酸乳球菌MN256、链球菌MN168，保存在本实验室。质粒载体:pMD19-T简单载体，购自宝生物工程(大连)有限公司引物:本文所有引物信息见表2-1。

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首先，统计了11种发酵食品中乳酸菌对7种抗生素的耐药率。发现各种食品中存在不同程度的耐药乳酸菌，耐药菌的比例与食品原料的来源、种类、加工环境和加工方法密切相关。其次，对从各种发酵食品中分离的14株耐药菌进行了进一步的深入研究，发现大部分菌株具有多重耐药性，有些菌株对某些抗生素具有极强的耐药性。然后，通过对已知耐药基因的聚合酶链反应扩增，发现一些细菌在质粒和/或染色体上具有耐药基因，而一些细菌不具有这些已知的耐药基因。最后，电转化实验证明，从上述菌株中分离出的一些耐药质粒具有跨物种水平转移的能力。
从我国22种传统发酵食品中分离出257株乳酸菌，用纸色谱法筛选出5株产γ-氨基丁酸的乳酸菌。其中，发酵乳杆菌MT133产γ-氨基丁酸能力最强。经过发酵条件的初步探索，确定最佳发酵条件为:底物浓度0.25 mol/L，氯化钙浓度25 mmol/L，静态发酵84 h后，最终发酵液中γ-氨基丁酸浓度可达20.57 g/L。最后，对γ-氨基丁酸合成途径中的关键基因γ-氨基丁酸进行测序和克隆。采用菌落观察和菌落绘制方法，从257株乳酸菌中筛选出胞外多糖产量高的
乳酸菌。对4株胞外多糖产量高的乳酸菌进行了筛选和鉴定。其中肠膜明串珠菌一株，植物乳杆菌一株，嗜热链球菌两株。进一步研究了温度和碳源对乳酸菌胞外多糖产量的影响。发现最佳生长温度有利于胞外聚合物的总积累，而低温(25℃)有利于粘性胞外聚合物的形成。乳糖有利于嗜热链球菌和肠系膜乳杆菌产生胞外多糖，蔗糖有利于植物乳杆菌产生胞外多糖。乳酸菌Ln的胞外多糖产量。肠系膜样物质MT257可达335毫克/升