38000字硕士毕业论文荧光免疫吸附理论检测食品成分过敏原蛋白石蛋白的研究

论文类型：硕士毕业论文

论文字数：38000字

论点：过敏,牛乳,过敏原

论文概述：

食品过敏已经逐渐影响到了人们的生活水平和质量，食物过敏原的检测对保障过敏人群的健康起到十分重要的作用。而目前过敏原检测技术普遍存在价格昂贵、耗时长、灵敏度和特异性不高等缺

论文正文：

第一章导言

1.1食物过敏及其危害
美国对食物过敏儿童的最新调查结果显示，近590万18岁以下儿童患有食物过敏，其中39%有严重过敏症状，30%以上对各种食物过敏，尤其是坚果。2008年，疾病控制中心预测食物过敏问题将影响1/25的儿童，现在已经达到1/13。更严重的是，许多儿童对各种食物过敏，并且已经产生了严重的反应，患病率逐年上升。最近的调查结果证实，总人口中食物过敏的发生率已达到4%。

1.1.2食物过敏的危害
食物过敏因其免疫机制可导致一系列过敏症状，从不适到危及生命。临床上主要引起以下并发症:皮肤病(荨麻鼠疫、血管性水肿、湿鼠疫等)。)、呼吸系统疾病(哮喘、吸入性鼻炎等。)、胃肠疾病(呕吐、腹痛、腹部绞痛等。)，神经系统疾病(心血管症状，如过敏性休克等。)。一些豆子、坚果、鸡蛋、牛奶和鱼等。对物质的过敏反应甚至会危及生命。
目前，避免食物过敏的常见方法是禁止食用含有过敏原的食物。然而，在很长一段时间里，这往往会导致过敏人群营养摄入不足，导致营养不良。例如，1-9岁食物过敏儿童的xing、铁、锌、维生素D和维生素E的摄入量低于RDA规定值，仅为规定值的67%。因此，食物过敏严重影响了过敏患者的日常饮食和生活质量。

1.1.3食物过敏原及其特性
过敏原也称为过敏原或过敏原，是指在某些特定人群中可能导致过敏现象的抗原。对过敏患者健康构成威胁的食物过敏原主要来自食品中的过敏原蛋白、食品加工和储存中使用的食品添加剂以及含有过敏原蛋白基因的转基因食品。90%的过敏原是蛋白质，但并非所有蛋白质都能引起过敏反应。大多数具有抗原特性的蛋白质是分子量在10-70KDa范围内的糖蛋白，属于不同的蛋白质家族。过敏原蛋白的等电点大多小于7，这在食品加工(如加热或烹饪)中通常表现出一定的稳定性，甚至一些过敏原也能抵抗肠道消化。
过敏原蛋白分子具有致密的三维结构，其中大部分具有结构特征，如配位键、二硫键、糖基化等。许多过敏原具有共同或相似的抗原表位，当过敏发生时会导致交叉反应。食物过敏有一定的遗传性。如果父母一方有过敏史，儿童患病率为20-30%，如果父母双方都有过敏史，儿童患病率高达80%。蛋白质引起的过敏大多是过敏反应。有许多种类的食物会引起特定人群的过敏，对于一些过敏的食物，过敏原的种类也非常复杂。2004年，美国食品药品监督管理局提出了160多种食品过敏原进行产品标签，其中牛奶、鸡蛋、鱼、贝类、花生、大豆、坚果和小麦是八大过敏原，这些产品的含量约占总量的90%。各种环境风险因素在食物过敏原的发展过程中也起着重要作用。随着工业化程度的提高和严重的环境污染，过敏原种类逐渐增多，过敏症状种类不断增多，病情逐渐恶化。

1.2牛奶过敏及其主要过敏原

1.2.1牛奶过敏
牛奶是人们日常生活中经常摄入的一种营养物质。牛奶引起的食物过敏引起了广泛关注。牛奶过敏患者发生过敏反应时，临床症状大多是皮肤穿刺病变、呼吸系统疾病如气短、喘息、咳嗽、胃肠紊乱等严重病例，甚至过敏性休克直接威胁生命。为了满足4-6个月后婴儿的营养需求，婴儿需要摄入一定量的补充营养食品，富含氨基酸的乳和乳制品优选为婴儿的主要营养食品之一。因此，食品中牛奶过敏原的检测尤其重要，尤其是在低过敏原食品中。调查显示，牛奶过敏的发生率在人群中为0.3-7.5%，在儿童中为0.1-7.5%，其中1岁以下婴儿的发生率为2-3%。牛奶过敏不同于花生过敏，也不是终身过敏现象。随着年龄的增长，一些患者会产生免疫耐受，过敏现象甚至会逐渐消失。例如，3岁以上儿童牛奶过敏的发生率将降至0.3%。来自不同国家的学者研究了引起牛奶过敏反应的过敏蛋白的剂量。结果表明，不同体质的人引起过敏反应的牛奶过敏蛋白剂量不同。乳清蛋白在食品工业中被用作一种常见的食品添加剂，这增加了食品中潜在牛奶过敏原的可能性。牛奶过敏还影响到其他与食品生产无关的行业，如化妆品和制药行业，导致相关产品也引起过敏患者的过敏反应。因此，建立快速、灵敏、特异的牛奶过敏原检测方法是保护牛奶过敏人群合法权益的关键措施，也有利于生产低过敏性食品，从而提高牛奶过敏患者的生活质量。

第二章牛奶α-乳清蛋白的分离纯化

2.1简介
牛奶富含蛋白质，是人们日常生活中的主要营养来源之一。α-乳清蛋白被认为是牛奶中的优选营养素，因为它含有大量色氨酸。α-乳清蛋白约占牛奶乳清蛋白总量的20%，含有123种氨基酸，3种基因型，分子量约为14.4kDa，是一种含有4个二硫键的球形结构蛋白。牛奶a-乳清蛋白和人乳a-乳清蛋白的氨基酸残基具有很高的相似性，是新生儿非常重要的蛋白质来源，但该蛋白质被认为是牛奶中的主要过敏原之一。本章采用常规方法脱脂，等电点沉淀去除酪蛋白，离子交换层析和凝胶过滤层析纯化α-乳清蛋白，SDS-PAGE鉴定蛋白质纯度，Lowry法测定蛋白质浓度，获得高纯度α-乳清蛋白，为单克隆抗体的制备和样品检测提供原料保障。

第三章抗牛α-乳清蛋白单体................................32-48
3.1导言................................32-33
3.2材料和仪器................................33-34 [/BR/] 3.2.1主要材料................................33
3.2.2主要试剂................................33[/比尔/] 3.2.3主要文书................................33-34
3.3主要解决方案的准备................................34-36[/比尔/] 3.4实验方法................................36-40
3.5结果和分析................................40-45
3.6讨论................................45-47
3.6.1动物免疫................................45-46[/溴/] 3.6.2单克隆抗体的制备................................46-47
3.6.3抗体的纯化和表征................................47
3.7本章概述................................47-48
第四章荧光量子点标记单克隆抗体................................48-59[/比尔/] 4.1导言................................48-49[/ BR/] 4.2材料和仪器................................49 [/溴/] 4.2.1主要试剂................................49
4.2.2主要文书................................49
4.3主要解决方案的准备................................49-50
4.4实验方法................................50-51
4.5结果和分析................................51-56[/比尔/] 4.6讨论................................56-57 [/BR/] 4.7本章概述................................57-59[/溴/]第五章量子点标记的单克隆................................59-71
5.1导言................................59
5.2材料和仪器................................59-60[/溴/] 5.2.1主要试剂................................59
5.2.2主要文书................................59-60
5.3主要解决方案的准备................................60[/比尔/] 5.4实验方法................................60-63[/比尔/] 5.5结果和分析................................63-69
5.6讨论................................69-70

结论

本文采用色谱法从乳清中分离纯化α-乳清蛋白，并将其作为抗原免疫小鼠。用细胞融合技术制备杂交瘤细胞。通过筛选、亚克隆、有限稀释和腹水诱导方法制备单克隆抗体。腹水用辛酸铵结合沉淀法纯化，获得单克隆抗体。在此基础上，用EDC和NHS偶联剂共价结合表面带有羧基修饰的荧光量T点CdSe/硫化锌的单克隆抗体，用葡聚糖凝胶-G200过滤层析实现分离纯化。最后，验证了量子点标记单克隆抗体的特异性，并以此为原料进一步研究了食品中过敏原α-乳清蛋白的检测。
(1)用were琼脂糖凝胶快流弱碱性阴离子交换树脂和葡聚糖凝胶G-75分离纯化(X-乳清蛋白)。所得α-乳清蛋白纯度大于95%，产率约为20.5%，能够满足后续单克隆抗体制备过程中免疫小鼠所需的纯度和剂量。
(2)以纯化的α-乳清蛋白为抗原免疫小鼠，用酶联免疫吸附试验检测免疫小鼠的血清滴度。当小鼠血清效价达到100，000以上时，杀死免疫小鼠，制备脾细胞悬液。采用细胞融合技术融合脾细胞和骨髓瘤细胞，观察筛选融合获得的杂交瘤细胞，亚克隆培养强阳性孔细胞，最终获得22株单克隆抗体，选择生长良好的细胞株，体内诱导腹水法制备富含单克隆抗体的腹水，酶联免疫吸附法检测腹水效价达到3xl05，腹水中的单克隆抗体用辛酸-硫酸铵联合沉淀法纯化，用SDS-PAGE电泳表征单克隆抗体的纯度。同时，采用间接竞争酶联免疫吸附法和蛋白质印迹法对单克隆抗体的活性和特异性进行了评价。结果表明，该单克隆抗体活性好，特异性高，与牛奶中其他主要过敏原蛋白无交叉反应，为后续量子点标记提供了理想的物质保障。