38110字硕士毕业论文Chelex-100模板检测H19印迹位点遗传多态性及其在山西汉族人群中的分布

论文类型：硕士毕业论文

论文字数：38110字

论点：印记,基因,甲基化

论文概述：

本文是医学硕士论文， Chelex-100法提取的DNA能成为甲基化敏感限制性内切酶Hha I酶切底物应用于印记基因H19上游区域差异甲基化的检测，Hhal消化后PCR扩增两条条带光密度比值在3.63—4.13区间时可

论文正文：

前言

印记基因的分离、鉴定和作用机制研究表明，许多与印记基因和印记控制中心相邻的序列都有脱氧核糖核酸甲基化修饰和差异甲基化序列，来自亲本的等位基因甲基化水平在差异甲基化区域不同。例如，当印记基因来自亲本来源时，亲本等位基因高度甲基化，而亲本等位基因未甲基化或低甲基化，从而使转录因子或其他转录相关蛋白与其结合能力不同，并进一步使亲本等位基因的表达能力不同，即印记产生，而亲本印记基因正好相反。
……

材料和方法

1材料
脱氧核糖核酸扩增仪(基因扩增仪9700；ABI；美国)
实时聚合酶链反应系统Mx3000P地层基因；美国
紫外可见分光光度计(Ultrospec 4300pro通用电气医疗；(英国)
洁净工作台(FLC-3型；哈尔滨东联公司；哈尔滨)
超纯水装置(SZ-93；上海亚龙生化仪器厂；上海)
旋转式搅拌机(QL-901；麒麟医疗器械厂；江苏)
便携式压力蒸汽灭菌器(GMSX-280；北京永光医疗器械厂；北京)
精密电子天平(OHAUS)台式离心机(TGL-16B；上海安亭科学仪器厂；上海)
恒温水浴箱。(CS501，；上海卓越仪器有限公司
高速低温台式离心机(2-16K；西格玛；美国)

2方法
根据相关文献报道[7-10]，人H19基因是位于染色体llpl5.5区域印记基因簇中的亲本印记基因，即亲本等位基因甲基化，不能被甲基化敏感限制性酶切割，亲本等位基因未甲基化，可以被甲基化敏感限制性酶切割。这个问题在文献中有报道吗？研究了亲本印迹基因H19的上游区域。引物对AB和CD从文献中获得。引物对AB含有4个哈尔切割位点和VNTR位点，扩增长度约为1.7kb，引物对CD只含有VNTR位点，扩增长度约为500bp。实时定量聚合酶链反应引物对EF来自我们的实验室，扩增长度为147bp。引物序列如表1所示。(1)破坏红细胞。在400微升抗凝血剂中加入1微升和50微升P40。摇动钩子后，以13000转/分钟离心5分钟，弃去上清液，用TKM1液体悬浮细胞沉淀，钩子混合后离心，重复几次，直到上清液变成无色。(2)白细胞的破坏:将处理过的样品与TKI 500 11和20g/mlpk3nL混合，并在56℃水浴中孵育-5小时，直到液体完全透明。(3)-亚等容苯，一次苯/氯仿，一次氯仿萃取。每次提取都需要仔细彻底地混合水相和油相，以13000转/分钟的速度离心5分钟，并将水相尽可能转移到另一个离心管中。(4)向上清液中加入2.5倍体积的冰无水乙醇和1/10体积的3M乙酸钠，混合并混合，在-2℃下沉淀1小时，14，000转/分钟20分钟，弃去上清液，加入3倍体积的75%无水乙醇，14，000转/分钟20分钟，弃去上清液，空风干，加入适量去离子水溶解，并在-20℃下储存备用。

结果1……2
1。采用Chelex-100提取法提取的脱氧核糖核酸作为Hha酶消化底物，检测印迹基因H19上游区域的差异甲基化。结果……山西汉族人群印记基因H19上游区域YNTR位点12
br/] 2多态性15
探讨........18
1定量……18
br/]用于通过Chelex-100方法提取的脱氧核糖核酸2 Chelex-100提取的脱氧核糖核酸作为Hha酶切底物，用于检测印记基因H19上游区域的差异甲基化……18
结论……22

讨论

1切尔西-100法提取的脱氧核糖核酸的定量测定
在本实验中，需要适量的脱氧核糖核酸作为甲基化敏感限制性内切酶Hhal的底物。通过探索氯仿提取的脱氧核糖核酸作为Hhaⅰ酶消化底物的量，在总反应体积为20-11，HhaI(NEB)为30-37℃消化15小时的条件下，底物量以15ng为最佳。因此，在实验中用Chelex-100法提取的脱氧核糖核酸酶底物的量为15ng。由于Chelex-100法提取的脱氧核糖核酸不能用紫外分光光度法直接定量，故以拷贝数已知的标准物质为对照，采用实时定量聚合酶链反应方法进行定量。

2chelex-100提取的脱氧核糖核酸用作Hha酶消化底物，检测印迹基因H19
上游区域的差异甲基化，脱氧核糖核酸甲基化是蛋白质和核酸的重要修饰，是表观遗传学的重要研究内容之一，与生长发育、衰老、癌症和许多疾病密切相关。它一直是遗传学、肿瘤学、法医学等学科的重要研究内容之一。基于甲基化敏感限制性内切酶的分析方法是甲基化检测中常用的方法之一。它具有实验结果易于解释、成本低、对操作者要求低和同时研究基因组中多个甲基化位点的优点参考文献(省略)。甲基化敏感限制性内切酶法主要采用后消化聚合酶链反应技术。目前，该方法中使用的大部分脱氧核糖核酸底物是用年龄氯仿法提取的脱氧核糖核酸。氯仿法提取脱氧核糖核酸的优点是脱氧核糖核酸纯度高，量大，但对试验材料的初始量要求较高，实验周期长，方法复杂，难以满足法医实践中快速、简单、微量试验材料的要求。与粉末氯仿法相比，Chelex-100法提取脱氧核糖核酸简单快速，适用于微量检测材料。因此，它被广泛应用于法医实践。Chelex-100法用于法医实践中提取脱氧核糖核酸——它通常用于聚合酶链反应。脱氧核糖核酸聚合酶除了耐高温之外，与生物聚合酶相似。用Chelex-100法提取的脱氧核糖核酸聚合酶工作效率高，扩增效果好。生物反应的酶催化需要合适的温度、酸碱度、辅助因素等。比较了TaKaRa脱氧核糖核酸聚合酶和NEB甲基化敏感限制性内切酶Hha反应所需的反应缓冲液的组成。前者由MgCh和KCK三盐酸组成，后者由Mg(Ac)2、KAc、Tris-Ac和DTT组成。这两个组件是相似的。这为将Chdex-100法提取的脱氧核糖核酸作为甲基化敏感限制性酶Hha的底物应用于印迹基因H19上游区域的差异甲基化检测提供了可能性。
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结论

(1)Chelex-100法提取的脱氧核糖核酸可作为甲基化敏感限制性内切酶Hha底物，用于印迹基因H19上游区域的差异甲基化检测。Hhal消化后的聚合酶链反应扩增，当两个条带的光密度比为3.63 ~ 4.13时，可以区分亲本或亲本的遗传多态性条带。(2)印记基因H19上游区域的VNTR位点在山西汉族人群中具有较高的遗传多态性，可用于法医个体鉴定和亲子鉴定。
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