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论文范文通过模拟癌细胞转移的失巢环境,观察CD24对失巢凋亡的影响。

论文类型:论文范文
论文字数:
论点:细胞,肿瘤,基质
论文概述:

医学硕士论文:《CD24 影响卵巢癌失巢凋亡与转移侵袭》,细胞与基质的相互作用对于正常上皮细胞的存活与生长非常必要。正常上皮细胞一旦离开细胞基质,就会发生凋亡,这种凋亡方式叫失

论文正文:

细胞和基质之间的相互作用对于正常上皮细胞的生存和生长是非常必要的。一旦正常上皮细胞离开细胞基质,它们将经历凋亡,这被称为失巢凋亡。失巢凋亡能保持正常细胞增殖、分化和凋亡的动态平衡,从而保证细胞和组织环境的稳态。抗失巢凋亡和锚定依赖性是恶性肿瘤细胞的特征,在肿瘤细胞转移中起着重要作用。为了完成肿瘤的远距离转移和侵袭,肿瘤细胞必须从原来的肿瘤体中分离出来,进入血管或淋巴管,而正常细胞从细胞基质中分离出来,细胞和基质之间调节细胞存活的信号就会中断,细胞就会死亡。恶性肿瘤最重要的特征之一是肿瘤细胞可以通过血管或淋巴管种植或转移到其他地方,从原来的位置脱落后继续生长。大约90%的癌症患者死于转移。肿瘤转移是一个多步骤、复杂的过程。这包括肿瘤细胞从原肿瘤体上脱落、转移过程中细胞外基质的退化、细胞迁移、非锚定依赖性生长、避免凋亡、血管再生、周围组织的侵入、细胞粘附、移动和远处定居的完成。在抗失巢凋亡的过程中,一些避免失巢凋亡的信号通路被激活。研究发现,死亡受体途径和线粒体途径在抗失巢凋亡过程中都被激活。细胞脱离基质并触发线粒体中抗凋亡蛋白Bcl-xL表达的下调。细胞与基质[分离后,激活死亡受体的Fas配体上调。近年来,已经发现粘附诱导失巢凋亡的抗性可以解释立体培养和标准单层培养中肿瘤细胞之间的细胞存活差异。近年来,发现粘附分子CD24在肿瘤的侵袭、转移和侵袭中发挥重要作用。CD24是一种高度糖基化的粘蛋白,含有27个氨基酸的小片段,通过甘油磷脂酰肌醇[10]与细胞表面相连。研究表明CD24的高度糖基化是高度可变的,并且依赖于细胞类型。作为膜蛋白,CD24的糖基化位点在细胞连接处作为分子间相互作用的信号传递介质,并介导细胞间和细胞基质间的粘附,这与淋巴细胞转移和神经网络形成有关[27,28]。p-选择素是CD24的唯一配体。在生理条件下,CD24介导中性粒细胞和单核细胞粘附到表达P-选择素的活化血小板和内皮细胞表面[29]。一些研究发现CD24在各种造血系统肿瘤和实体肿瘤中广泛表达,[30-34]。它还与肿瘤的侵袭、转移、复发和预后密切相关。在女性生殖系统中,CD24mRNA在卵巢乳头状腺癌细胞中的表达显著上调。免疫组织化学显示正常卵巢细胞不表达CD24,交界性肿瘤和上皮性卵巢癌有明显的高表达,CD24的高表达可显著缩短浸润性卵巢癌患者的生存期[11]。Yang等人发现CD24在高转移性肝细胞癌细胞和复发性肝细胞癌组织中显著过表达。抑制CD24的表达可以减少细胞增殖、转移和侵袭。经导管动脉化疗栓塞可降低CD24阳性肝细胞癌患者的复发率。还发现CD24与活化的Wnt/β-连环蛋白途径有关。这表明CD24的过表达与肿瘤的高侵袭、高转移和高增殖有关。实验还表明,CD24的高表达是肝细胞癌手术后预后不良的一个指标,[12]。由于CD24参与细胞间粘附和细胞间粘附,并且肿瘤细胞的特征是癌细胞从固有肿瘤体脱落并从细胞间分离,所以细胞间粘附不像正常细胞那样引起失巢凋亡,CD24在肿瘤细胞抵抗失巢凋亡的过程中起作用吗?它的机制是什么?阻断CD24表达对肿瘤抗失巢凋亡能力有什么影响?
材料和方法
材料
(一)细胞株:高转移性卵巢癌细胞株HO-8910 ppm购自中国科学院(上海)细胞库,卵巢癌细胞株A2780购自中国典型培养物收集中心(武汉)。
(二)主试剂:1。RPMI-1640中型:海克隆公司的产品。2.小牛血清:美国GIBCO产品,分装后储存于-20。使用时,将10%的体积添加到RPMI-1640培养基中。3.PBS:购自武汉卜式生物科技有限公司,每包装有1000毫升双蒸水,用磁力搅拌器搅拌至完全溶解,分装,高压后储存于4℃。4.胰酶粉:购自美国Amresco公司,称取0.25克胰蛋白酶粉,加入100毫升溶液,加入0.02克乙二胺四乙酸,配制浓度为0.25%的溶液用于细胞消化,充分溶解,过滤,灭菌,4度保存。5.三唑溶液:6。美国吉博公司的逆转录聚合酶链反应试剂盒:日本东洋博公司。7 .聚-hema(羟乙基聚甲基丙烯酸酯):美国西格玛公司的产品(由武汉大丰科技公司代理)。它是一种阴离子聚合物,能抑制细胞粘附,使细胞悬浮生长。8.琼脂糖:武汉大丰科技有限公司9。SYBR绿色ⅰ荧光染料(购自美国Biotium Inc .)。10.Annexin诉FITC试剂盒:购自南京凯吉生物技术有限公司11。CD24单克隆抗体:购自eBioscience公司(武汉古泰生物技术有限公司代理)。12.GAPDH引物序列:sense:(购自上海英军邀请生物技术有限公司)。13.制造商阶梯:武汉大丰公司代理14。DEPC:核糖核酸酶抑制剂
(三)主要仪器和设备1.37恒温二氧化碳细胞培养箱(3319序列号,美国福马科学公司)2。YJ-1450D医用无菌控制台(苏州净化设备公司)3。恒温水浴箱(DZ-84,上海跃进医疗器械厂1) 4。电子砝码(梅特勒-托利多)5。台式高速低温离心机。倒置相差显微镜(奥林巴斯,日本)7。光学显微镜(奥林巴斯,日本)8。全自动聚合酶链反应仪(T3热循环器,美国Biometra)9。恒温恒压电泳仪(Biometra,P25)10。凝胶成像系统(01ympus,TH4-200)11。凝胶电泳分析系统(生物光谱交流想象系统)12。高温烘干箱(上海景洪实验设备有限公司)13。紫外分光光度计(DU650,贝克曼,美国)14。Longenaustauscher SG 15。-80℃冰箱(热成型-86℃ Ultrezer) 16.4℃,-20℃冰箱(西门子冰箱)17。恒温振荡器(江苏金坛荣华仪器制造有限公司)18。EPPENDOF)19。FACScan
2。测试方法
(1)细胞培养1。培养条件:细胞在含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中,在37℃,5% CO2培养箱中培养。2.细胞传代:当细胞相互融合并且整个培养瓶的大部分底部被细胞覆盖时,需要传代。从培养箱中取出细胞,将瓶中的旧培养基倒入超净台。向瓶中加入1毫升胰酶,轻轻摇动培养瓶,使胰酶与所有细胞表面充分接触,然后倒出胰酶,加入适量含有0.25%乙二胺四乙酸的胰酶,将细胞培养瓶置于倒置显微镜下观察。当细胞质收缩,细胞间隙增大变宽时,弃去胰酶消化液,加入适量1640培养基,用吸管吸瓶中的培养液,反复轻轻吹瓶壁上的细胞形成细胞悬液,然后将按1∶2比例接种的新培养瓶放入恒温培养箱中继续培养。3.细胞冷冻保存:对数生长期的细胞在前一天用胰蛋白酶消化,收集并在离心管中计数,离心除去消化液和培养基,加入0.1毫升二甲基亚砜和0.9毫升小牛血清,分装在冷冻保存管中并标记。冷冻保存液中细胞的最终浓度一般为5×106~1×107/ml。放入4℃冰箱中1小时,放入-20℃中约半小时,然后放入-80℃或液氮中保存。4.细胞复苏(Cell Responsibility):将从-80℃或液氮中取出的冷冻保存管立即放入37℃恒温水浴箱中,不时摇动使其尽快融化。融化完成后,冷冻保存管中的液体通过无菌台中的吸管转移到离心管中,加入2ml预热的1640培养基,低速离心除去上清液,加入合适的培养基,轻轻吹上清液转移到培养瓶中,将培养瓶置于37℃恒温细胞培养箱中培养。
(2)CD24的检测一些研究表明小细胞肺癌表达CD24[25],因此非小细胞肺癌被用作CD24表达的阳性对照。1.细胞悬液的制备:对数生长期的细胞用含有0.25%乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化,在离心机中低速离心,然后用含有10%小牛血清的1640培养基制备成单细胞悬液。2.细胞计数:(1)清洁计数板:用酒精浸泡计数板和盖玻片,并用丝布轻轻擦干。(2)样品添加:用胰蛋白酶消化细胞制成的单细胞悬液用吸管轻轻吹,然后稍微吸收。将一滴细胞悬液添加到计数板的盖玻片一端的边缘,并将计数板调平以填充盖玻片和计数板之间的细胞悬液。样品不能过多溢出盖玻片,也不能太少或有气泡。(3)计数:在显微镜下观察计数板四角大方格中细胞的数量。当细胞被压向中线时,计数左边而不是右边,不要写下[。(4)计算:细胞数/ml原液=(4个大细胞总数/4)×1043。接种:将细胞浓度调节至3×105/ml,接种到六孔板中。放入37℃,5%CO2培养箱中。