55200字硕士毕业论文蜗牛诱导口腔癌细胞上皮组织转化并促进其获得肿瘤干细胞样特征

论文类型：硕士毕业论文

论文字数：55200字

论点：细胞,肿瘤,转移

论文概述：

口腔癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，局部发和颈淋巴结转移是其致死的主要原因 。尽管口腔癌的治疗策略和治疗水平已有很大进步，但患者五年生存率多年来未见明显改善。

论文正文：

第一部分，由pEGFP-N1-蜗牛

真核表达质粒构建的蜗牛基因家族是诱导EMT发病的关键转录因子，编码具有锌指结构的转录因子，包括蜗牛1 (Snail)、蜗牛2(Slall)、蜗牛3 (SMUC)。蜗牛是蜗牛科的第一个成员，最早是在果蝇中发明的，在脊椎动物植物[17]的胚层形成过程中起着重要作用。作为上皮钙粘蛋白的转录抑制因子，[17，18]，它可以与上皮钙粘蛋白的启动子结合来抑制上皮钙粘蛋白的表达，从而在胚胎发育和肿瘤转移过程中诱导上皮间质转化攻击[13]。不仅如此，蜗牛还具有屏蔽干细胞的功能。在肿瘤细胞中，蜗牛的异位表达可以提高肿瘤细胞的克隆率，使肿瘤细胞更容易在远处定居并表达肿瘤干细胞标志物[14]。本实验构建了pEGFP-N1-蜗牛真核表达质粒，为进一步研究蜗牛诱导口腔癌细胞发生上皮间质转化及其具有类干细胞特性的作用机制奠定了实验基础。

1材料和方法

1.1主要实验材料
1.1.1实验细胞SCC9肿瘤上皮细胞，可从美国ATCC公司获得。
1.1.2 Thermo，美国，洁净工作台，德国，奥林巴斯，日本，血细胞计数板，Thermo，美国，高速冷冻离心机(HERAEUS，德国)，基因扩增仪(Eppendorf，德国)，琼脂糖凝胶电泳仪(Pharmacia，美国)，聚合酶链反应成像仪(Bio-Rad，德国)，水密恒温培养箱(GNP-9080BS-III，上海缪欣医疗器械制造有限公司)，温控培养摇床(SCS-24，上海离心机械研究所电缆公司)，数显恒温水 高压灭菌锅(美国TSAOSHIN)、电子天平(日本岛津)、五易酸度计(美国梅特勒-托利多)、培养瓶(美国康宁)、培养皿(美国科斯塔)、极压管、聚合酶链反应管常规耗材等。
1.1.3实验试剂DMEM-F12培养基(GIBCO，美国)、进口胎牛血清(FBS，GIBCO，美国)、0.25%胰蛋白酶(GIBCO，美国)、双抗体(GIBCO，美国)、氢化可的松(Sigma，美国)、TRIzol(Invitrogen，美国)、DEPC (Sigma，美国)、逆转录试剂盒(TaKaRa，日本)、琼脂凝胶(GENE TECH，CH)、金ViewTM核酸染料(上海克百威基因科技有限公司)、脱氧核糖核酸凝胶回收试剂盒(Omega，美国)、pMD1 2×YT培养基(南京医科大学口腔研究所提供)、前Taq酶(日本TaKaRa)、脱氧核糖核酸标记DL2000(日本TaKaRa)、无内切质粒minikit ii质粒提取试剂盒(美国欧米茄)、卡那霉素(美国ATCC)、Hindⅲⅲ和bamh限制性酶(日本TaKaRa)、pEGFP-N1载体(# U55762，南京医科大学口腔研究所提供)、各种分析纯试剂等。

1.2实验方法
1.2.1 SCC9细胞培养和传代培养SCC9肿瘤上皮细胞株按照ATCC官方要求在DMEM-F12全培养液(含10%胎牛血清、1%双抗体、400 ng/毫升氢化可的松)中培养，并置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。当细胞生长和融合达到80-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3的比例传代培养。1.2.2从样品中提取总核糖核酸(1)实验前的准备:将极压管、聚合酶链反应管和其他可能与核糖核酸接触的消耗品在0.1% DEPC中放置24小时，取出，高温高压灭菌，干燥备用。(2)实验步骤:①培养的细胞用PBS洗涤两次，用胰蛋白酶消化，用含血清培养基中和，离心，弃去上清液，用1mL三唑悬浮，转移到极压管中，室温放置5min；；(2)加入0.2毫升三氯甲烷，剧烈摇动15秒，室温放置10分钟，等待分层。

第二部分蜗牛的过度表达诱导口腔癌细胞上皮间质转化并促进其体外高侵袭和转移能力

上皮间质转化的过程称为上皮间质转化(EMT)，在胚胎发育中起重要作用。EMT的过程是描述形态和分子变化的过程。随着细胞上皮特性的丧失和间充质特性的获得，细胞形态由铺路石样变为成纤维细胞样，细胞侵袭和转移能力增强。这一过程中的变化受一系列转录因子的调节，包括蜗牛、蛞蝓、ZEB和崔斯特·[27]。越来越多的研究证实，上皮间质转化在肿瘤侵袭和转移中起着重要作用。肿瘤细胞发生EMT后，细胞间粘附能力减弱，易于分散，肿瘤细胞离开原发灶后可侵入邻近组织。同时，肿瘤细胞获得强大的侵袭能力，突破内皮屏障进入体循环，细胞可以在血液中独立于支持物存活。当血液循环吸附到远处的血管时，细胞离开体循环，最后，在远处[28，29]定居后，肿瘤细胞可以在新环境中形成转移灶。然而，在口腔癌细胞SCC9中，关于蜗牛是否能诱导上皮间质转化的研究却很少。因此，在本实验中，SCC9细胞通过增强Snail的体外表达过度表达Snail，从而观察转录抑制剂Snail诱导EMT后对口腔癌细胞高侵袭转移能力的影响，进一步探讨Snail在口腔癌侵袭转移中的作用。
1材料和方法
1.1主要实验材料
1.1.1实验细胞SCC9肿瘤上皮细胞，可从美国ATCC公司获得。
1.1.2美国Thermo，德国clean bench，倒置相差显微镜(奥林巴斯，日本)，血细胞计数板(北京众仙恒业仪器有限公司)，普通离心机(Thermo，美国)，高速冷冻离心机(HERAEUS，德国)，基因扩增仪(Eppendorf，德国)，7300 ABI实时聚合酶链反应仪(Applied Biosystems，美国)。

目录
第一部分聚乙二醇磷酸酯-N1-蜗牛................7
1.1材料和方法................7
1.2结果................14
1.3讨论................19
1.4结论................21
第二部分过度表达蜗牛............................22
2.1材料和方法................22
2.2结果................30
2.3讨论................36
2.4结论................37[/溴/]第三部分蜗牛诱导型口的过度表达……38
3.1材料和方法................38
3.2结果................40
3.3讨论................44

小结
口腔癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，局部发生和颈部淋巴结转移是死亡的主要原因。虽然口腔癌的治疗策略和水平取得了很大进展，但患者的5年生存率多年来并没有明显提高。肿瘤细胞的局部浸润和远处转移是其顽固和难治的根本原因。然而，它们发生的机制尚不清楚。近年来，EMT可能在恶性肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用，引起了广泛关注。研究发现蜗牛通过抑制关键调节因子——上皮钙粘蛋白的表达，在上皮间质转化过程中起着关键的调节作用。

参考
[1]af室，grosac，macdonald ic .气象站癌细胞的分解和生长. natrev cancer，2002 .2(8):563-72。
[2]潘特尔·克，右侧布朗克霍夫。解剖转移级联。癌症杂志，2004，4(6):448-56。
[3]泰瑞·JP。肿瘤进展中的上皮间质转化。Nat RevCancer，2002，2(6):442-54。
[4]霍利尔·BG，埃文斯·克，马尼·萨。上皮-间质转化和癌干细胞:对抗癌症治疗的联盟。《乳腺生物瘤》，2009，14(1):29-43。[/比尔/][5]鲍姆，塞特曼，昆兰议员。发育和疾病中上皮和现生状态之间的转换。塞明细胞发展生物学，2008，19(3):294-308。
[6]吴晔，周BP。蜗牛:不仅仅是急诊。细胞Adh Migr，2010，4(2):199-203。[7]吴勇，周平。上皮-间质转化在癌转移中的新见解。生物化学生物物理学学报(上海)，2008，40(7):643-50。
[8]涅托马。锌指转录因子蜗牛超家族。Nat RevMol细胞生物学，2002，3(3):155-66。
[9]周百平，邓军，夏伟，等. GsK-3β介导的磷酸化对蜗牛的双重调控在控制上皮-间充质转化中的作用.Nat Cell Biol，2004，6(10):931-40。
[10]帕兹涅卡斯·瓦(Paznekas WA)，冈岛克也(Okajima K)，舍尔策·姆(Schertzer M)等人，人类蜗牛基因(SNAI1)和相关加工假基因(SNAI1P)的基因组组织、表达和染色体定位。基因组学，1999，62(1):42-9。