37900字硕士毕业论文甘菊成花相关基因的表达模式及功能研究

论文类型：硕士毕业论文

论文字数：37900字

论点：菊花,甘菊,花期

论文概述：

本文作者以菊花的近缘野生种为材料，使用转基因技术、PCR技术和亚细胞定位等常规分子生物学技术结合转录组高通量测序、升级版数字芯片表达谱和生物信息学等高新技术，初步解析了甘菊成

论文正文：

介绍

菊花是我国传统名花，但其花期是影响人们四季享受菊花的最重要限制因素。菊花的生长状态和花期经常受到环境因素的影响，如生长季节的温度和日照长度(Langton，1977)。根据花期，菊花可分为三种类型:秋菊、寒菊和夏菊菊。然而，大多数菊花品种一般需要一定数量的短日照时间才能进入花芽分化阶段，因此菊花的自然花期主要在11月左右，只有少数光周期不敏感的品种能够在夏季或初秋开花，这在一定程度上限制了它们的观赏价值和市场适用性(安德森，2006；赵等人，2009).育种科学家试图分析温度和光周期对菊花花期的影响，以实现菊花的年产量，但是使用这些方法控制菊花花期的效果非常有限(凯茜，169)。利用分子育种方法来提高菊花的花期具有广阔的应用前景，但菊花的开花机理需要首先了解。鉴于菊花遗传背景复杂，开花机制研究进展缓慢，笔者以菊花野生近缘种南瓜子(C.lamndulifolium)为研究材料，首先利用Illumina/Solexa Hisq2000平台获取甘菊转录组信息，然后利用升级后的数字基因表达技术。DGE)选择洋甘菊出芽过程中特异表达的基因群，验证了花芽分生组织特征基因DFL和DenFUL的功能。为了初步分析菊花形成的分子机理，为菊花分子育种阶段改良提供参考。

1.1研究甘菊开花机制对提高菊花花期的意义
早在70年前，俄罗斯植物学家尼古拉·瓦维洛夫就预言野生相关物种将在农业发展中发挥重要作用。在数百万年的进化过程中，野生亲属积累了各种遗传变异。因此，遗传多样性非常丰富，而现代栽培品种的遗传多样性非常贫乏，这可以在脱氧核糖核酸水平上直观地看出(Tankslyand cCouch，1997)。此外，野生物种在长期进化过程中积累了许多优良性状，如花期、抗逆性等优良品质，这些都是育种者非常感兴趣的。中国野生花卉资源丰富，但实际开发应用于观赏植物育种的野生花卉种类并不多。近年来，随着基因组测序等技术的突破，基因组学、表型基因组学等“基因组学”和生物信息学迅速发展，作物育种理论和技术发生了重大变化。以分子标记育种和转基因育种为代表的现代作物分子育种技术逐渐成为世界作物育种的主流，也正在成为中国作物遗传改良的重要手段(李宇等，2010)。然而，分子育种技术在观赏植物中的应用才刚刚开始。分子育种技术可以将野生舟状骨的优良基因资源引入观赏植物栽培品种中，改变观赏植物定点定向的特性，培育色彩新颖、外形美观、抗性优良、花期延长的观赏植物新品种。
菊花是一个种间隔离机制不完全的类群。大量研究表明，菊花是由菊花中几种野生种杂交而成的异源多倍体。，2005)，这使得菊花的分子生物学研究变得困难。甘菊是菊花中独特的二倍体物种(2n=2x=18)，也是菊花的原始亲本之一。它的生物学习性在一定程度上与栽培菊花相似。此外，甘菊的头花序在开花植物中处于最进化的位置，这也显示了花形成的复杂性。它已经引起了现代生物学家的广泛关注，并成为进化发展生物学研究中一个有吸引力的模型(Gocal et ai，2001；奥托林，2003).目前，虽然高等植物成花的分子调控机制在模式植物中已有明确的研究，但洋甘菊成花机制的研究才刚刚起步。根据拟南芥和作物的研究成果，通过正向遗传学和反向遗传学分析菊花分生组织特征基因在菊花开花过程中的作用，对菊花开花期的改良具有积极意义。

1.2高等植物成花机理的研究进展

1.2.1高等植物开花的重要性
高等植物开花理论在农业生产中具有重要的指导意义，并已广泛应用于品种繁殖、异地引种、开花控制、营养生长和生殖生长调控等实践中。此外，开花是高等植物发育中最显著的阶段，在植物发育生物学的研究中起着极其重要的作用。在植物发育生物学的研究中，人们往往强调从植物中寻找“重要”性状的形成规律，因此，在过去很长一段时间里，植物发育研究的中心问题一直是植物开花诱导问题。近年来，植物发育生物学已成为植物科学的前沿领域，这在很大程度上得益于花发育遗传控制研究与开发的重大突破。

2转录组洋甘菊不同生长阶段高通量测序

转录组学是一门从整体水平研究细胞中基因转录并探索基因转录调控的学科(Huang等人，2007)。Illumina Solexa高通量测序技术可以检测低丰度和新转录物，并帮助研究人员发现待测样品中基因结构的微小变化。该技术已广泛应用于相关作物转录组的研究。目前，基因库数据库中8种菊花只有7，016个序列，数据极其有限，限制了菊花开花调控的分子机制研究，使得菊花开花改良的分子育种难以实现(安德森，2006)。在这一部分的研究中，作者利用该技术获得了一批洋甘菊不同生长阶段、胁迫处理和各种组织的转录本。通过分析，获得了甘菊成花相关基因的许多重要信息，为分析甘菊成花机理和利用转基因技术改善菊花花期提供了重要的基础信息。

2.1材料和方法

2.1.1植物材料的处理和核糖核酸提取
为了获得尽可能多的基因资源，混合后选择了包括不同发育阶段、胁迫处理和洋甘菊多器官在内的样品进行测序。洋甘菊不同发育阶段的材料:洋甘菊种子用次氯酸钠溶液灭菌，然后播种在1/2MS培养基中。当植物根系长到3-4厘米时，将种子移植到12x8轻质石洞板中，在16h/8h长的人工气候室中培养。植株长成6片真叶后，移植到轻质石质花盆中:泥炭=1:1，然后转移到短日照气候室中12/12小时诱导开花。以洋甘菊生长发育过程中不同阶段和不同光周期诱导的植物为材料，包括长日照营养生长阶段(16/8h)的6片真叶植物；短日诱导:6株真叶植物(12/12h后5天)，8株真叶植物，9-1株真叶植物，出芽植物(约13片叶)，早花植物和全花植物。上述材料取自植物的顶部和它下面的两对幼叶。光周期处理于上午8: 00开始，时间为17；00(黄河，2012)。

3洋甘菊种苗发育数字芯片.........51
3.1材料和方法.........51
3.2讨论.........53
3.3结果.........63
4洋甘菊DfL基因功能的研究.........70
4.1材料和方法.........70
4.2结果.........78
4.3讨论.........97
5洋甘菊基因功能研究.........102
5.1材料和方法.........103
5.2结果.........105

结论

“谁是秋来华少的主人，谁总是领导群众是菊花”。中国菊花爱情始于魏晋，盛于唐宋，成熟于明清。从原始野菊花开始，经过2000多年的培育，菊花人工栽培取得了巨大的成功。有许多种类和姿势。菊花“自始至终只能食用，因为它只是一种小植物，为他人立下了功勋。”“如果你增加颜色、香味、美味、休闲和优雅，你可以在山川和山谷中自娱自乐。”在一定程度上，菊花已经成为中华民族精神的象征。然而，由于菊花固有的生物学特性，深秋开放的菊花受到学者和人们的高度尊重，品味高雅又大众化，但仍有一点遗憾。目前，如何调整花期享受菊花四季，弘扬传统菊花文化，提高菊花产业效益，增加从业人员收入一直是菊花育种者的目标。在此基础上，以野生菊花品种为材料，运用转基因技术、聚合酶链反应技术和亚细胞定位等常规分子生物学技术，结合转录组高通量测序、数字芯片表达谱升级和生物信息学等高科技技术，初步分析菊花成花调控分子机制的科学问题。
(1)通过高通量测序成功构建了洋甘菊转录组文库，为洋甘菊的成花及其他生物学研究提供了一个有价值的基因库。该文库包含108，738个单基因，通过蛋白质同源性比较注释了58，093个单基因。这些单基因的COG和GO分类概述了整个甘菊转录组的功能。从这些注释的单基因中，鉴定出6204个单基因编码转录因子。这些转录因子分别属于57个家族，其中8个转录因子基因家族与开花相关。此外，还鉴定出92个与甘菊开花相关的同源基因，分别属于光周期途径、赤霉素途径、春化途径、自主途径和FRI依赖途径。通过参考，初步筛选出56个可用于菊花花期改良的候选基因。
(2)通过升级的数字芯片表达谱，发现了甘菊萌芽过程中特异表达的基因群。甘菊苗期和出芽期共有14406个单基因基因上调或下调2倍以上。这些数据从三个角度进行了分析:GO条目、代谢途径的显著富集和转录因子的差异表达。基本代谢途径中的碳水化合物和淀粉代谢途径，气体代谢和代谢途径中的基因，以及转录因子家族，如MIKC，SBP，YABBY。东盟区域论坛。并参与洋甘菊成花的调控。通过对春黄菊光周期途径、赤霉素途径、自主途径和春化途径中重要基因表达模式的分析，发现大部分促进开花基因的表达水平在春黄菊出芽时有所提高。

参考
1。abem，kobayashi y，yamamoto s，daimoni，yamaguchi a，ikeday，ic hinokih，notaguchi m，gotok科学2005；309 (5737): 1052-1056。
2。阿布-埃尔瓦法SF，比特纳B，嘉特，舒尔茨-巴克斯罗G，霍曼努，穆拉莎-高尔滕斯E，容格，米勒埃。引用该论文[。实验植物学杂志2011；62( 10): 3359-3374。
3。阿查德、巴格小时、查皮埃、赫登、范德斯特拉滕、根斯克·莫里茨、哈伯尔德·NP。植物胁迫激素乙烯通过花分生组织同一性基因的依赖调节控制花的转变[。美国国家科学院学报，2007；104(15): 6484-6489。
4。阿查德·帕尔德、廖·勒、江·C、德诺斯·特、巴特利特·杰、傅克斯、哈伯尔德·NP。戴尔拉斯有助于植物光形态发生[。植物生理学2007；143(3): 1163-1172。
5。阿查德·帕尔德、弗莱岑·WH、范德斯特拉滕·德、哈伯尔德·NP。乙烯通过调节DELLA蛋白生长阻遏物功能来调节拟南芥的发育[[]。植物细胞2003；15(12): 2816-2825。
6。亚当·H，朱安妮·S，奥里乌·Y，莫西洛·F，里乔·F，杜瓦尔·Y，特雷弗·JW。参与油棕花结构测定的MADS盒基因的功能表征[[]。实验植物学杂志2007；58(6): 1245-1259。
7。阿拉巴迪、奥亚马、扬诺夫斯基、哈蒙·FG、马斯普、凯·萨。在拟南芥昼夜节律钟内TOCJ和LHY/CCAI之间的相互调节。科学2001；293(5531): 880-883。
8。拟南芥液泡葡萄糖转运蛋白ⅰ的鉴定和功能表达及其在[·JJ种子萌发和开花中的作用。美国国家科学院学报，2007；104(7): 2537。
9。阿尔瓦雷斯-布约拉尔，李杰格伦，佩拉斯，金硒，伯格夫C，迪特拉GS，Vcrgara - Silva F，Yanofsky MR MADS -box基因进化超越花:在花粉，胚乳，保卫细胞，根和鸢尾属中的表达[。植物杂志2000；24(4): 457-466。
10。Amasino RM。春化和开花时间[。《2005年生物技术最新观点》；16(2)；154-158。