38620字硕士毕业论文肝细胞癌WNT-连环蛋白信号通路相关基因异常甲基化的研究
论文类型：硕士毕业论文
论文字数：38620字
论点：肝癌,基因,基因组
论文概述：
本研究仅初步发现这几个基因在肝癌中的甲基化状态，由于样本量有限，未能同肿瘤的病理学、TNM 分期、临床分级及预后生存指标等其它因素联合分析，仍需未来研究中加大样本量。
论文正文：
第一章文献综述
1.1肝细胞癌的遗传学、表观遗传学和分子途径研究进展
1.1.1肝细胞癌的流行病学
肝细胞癌是世界上最常见和最恶性的肿瘤之一。根据世界卫生组织全球癌症研究中心(GLOBOCAN)2008年的统计，它在男性恶性肿瘤发病率中排名第五，在死亡序列中排名第二，在女性恶性肿瘤发病率中排名第七，在死亡序列中排名第六。2008年，全球新增病例748，300例，死亡695，900例，其中男性是女性的两倍多。超过50%的新病例和死亡发生在中国[1，2]。HCC的发病率在世界各地不同，东南亚和中部及东部非洲最高，其次是中亚、西亚、北欧和东欧。HCC的高发区也是HBV感染的高发区。这些地区超过8%的人口患有慢性HBV感染
1.1.2肝细胞癌遗传学进展。在原发性肝癌中，肝细胞癌是最重要的组织学类型，占所有肝癌的75-80[4】。研究表明，一些肝癌患者具有明显的家族聚集性和遗传易感性，提示肝癌的发生可能与遗传因素有关。然而，应该指出，肝癌的发生涉及一个多因素、多步骤的癌变过程。单一因素可能不会直接导致肿瘤的发生。多种因素往往会产生协同效应，如HBV病毒/丙型肝炎病毒感染与甲胎蛋白1食物污染、酒精中毒和吸烟，这些因素会显著增加肝癌的发病率。HCC主要由HCV丙型肝炎病毒感染引起。发展中国家60%的肝癌患者患有慢性HBV感染，33%的肝癌患者患有丙型肝炎病毒感染。发达国家的比例分别为23%和20%，
第二章实验研究。HBV携带者的肝癌发病率是HBV阴性携带者[的100倍。黄曲霉毒素B1(AFB1)暴露和HBV感染会增加HCC [的风险4-7]。酒精性肝硬化和肥胖相关的非酒精性脂肪性肝病被认为是美国和其他发病率低的西方国家肝癌的主要原因
结论。值得注意的是，HCC的流行病学近年来发生了变化。HCC在美国和中欧的发病率已从低发病率地区变为高发病率地区，这可能与这些地区因注射吸毒而导致的肥胖症流行和丙型肝炎病毒感染增加有关。然而，在一些高发病率地区，如中国大陆和香港，由于广泛接种了HBV疫苗[8-10]，HCC的发病率已显著下降。尽管根据世卫组织2006年的建议，全世界只有27%的婴儿在出生后24小时内接种了第一剂HBV疫苗，但截至2008年，177个国家(91%)已将HBV疫苗加入国家婴儿免疫计划[11]，这在降低HBV感染率和HCC发病率方面发挥了重要作用。对于目前没有免疫疫苗的丙型肝炎病毒感染，预防策略包括从献血者中筛选丙型肝炎病毒抗体和对注射吸毒者进行针头控制。在撒哈拉以南非洲，通过改进作物储藏方法减少黄曲霉毒素污染也对减少HCC发病率产生了重大影响，[12]。
[3]
1.1.2.1肝细胞癌的基因组不稳定性和基因突变
肝细胞癌与其他肿瘤一样，具有基因组不稳定性或基因不稳定性[13，14]，表现为染色体不稳定性(非整倍体)和结构变异，包括基因突变、重排、拷贝数变异等。随着人类基因组序列的完成，人们已经开发出在全基因组范围内检测肿瘤细胞染色体异常的新技术，如基于微阵列或基因芯片的微阵列比较基因组杂交(Array CGH)技术，该技术能够以更高的分辨率检测肿瘤基因组的异常。Midorikawa等人[15]利用高通量寡核苷酸阵列技术分析了36例原发性肝癌样本基因组脱氧核糖核酸的拷贝数水平，发现肝癌细胞基因组的多个染色体片段发生异常变化。其中，扩增区常见于染色体1q、5p、5q、6p、7q、8q、17q和20q。然而，杂合性缺失(LOH)在1p、4q、6q、8p、10q、13q、16p、16q和17p中很常见，表明这些异常与肝癌的发生密切相关。上述工作为分离更多肝癌致病基因提供了选定的定位数据。来自国家人类基因组南方研究中心的研究人员基于基因芯片(13824个基因或ESTs)的CGH分析了41个肝癌样本，发现平均7.25%的基因组经历了基因拷贝数的变化。基因组拷贝数扩增区主要集中在染色体1q、6p、8q和9p上。然而，杂合性缺失区域主要发生在染色体1p、16q和19p上，[绘制了一幅相对精细的肝癌基因组异常图。除了染色体不稳定之外，肝癌样本中还存在一些基因突变，导致肿瘤抑制基因失活或癌基因激活。已经证实p53基因的失活与HCC病的发生发展密切相关。大量研究表明，HCC经常有高频率的p53基因杂合性缺失(25%-80%)。密码子249和p53的其他密码子的突变也被证实与HCC·[16-20的发生和发展密切相关。最近，其他肿瘤抑制基因，如PTEN，也受到了关注。研究人员发现，一些(9.5%)肝癌患者在PTEN [21号外显子5和8中有突变。Wnt/β-连环蛋白与机体发育和细胞分化功能相关，也参与其中。Terris等人[22]发现肝癌中β-连环蛋白基因外显子3的突变率为19%(14/73)。突变导致β-连环蛋白的稳定性增加，β-连环蛋白的聚集和活性导致异常，如肝癌肿瘤的基因组不稳定性和基因突变，这将影响基因转录和表达。
[5]
在以前的文献综述中，对目前文献中报道的肝细胞癌异常甲基化失活的64个基因进行了总结和归纳。这些基因广泛分布在各种染色体上。基因功能涉及细胞生长、发育、分化、凋亡等多种生物学过程。包括多种细胞信号通路，如p53通路、TGF-β诱导的抗肿瘤通路、STAT信号通路、RAS/ERK通路、AKT/PKB通路等。详见表1.1。本研究在前人研究的基础上，应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和硫化测序(BS)检测WNT/β-连环蛋白信号通路相关基因启动子区的甲基化状态。由于BS方法特别适合于鉴定某一基因在某一状态下的甲基化状态，如肿瘤组织，亚硫酸氢盐转化和聚合酶链反应扩增基因组测序已成为分析和比较特殊位点甲基化模式的金标准。这两种方法可用于实现对特定基因甲基化模式的定性、定量和定点研究。其次，在实验中心的前期工作中，应用阵列CGH技术对东北地区45例肝细胞癌组织的基因组水平进行了研究。检测肿瘤组织的基因拷贝数变化，绘制基因组不平衡染色体图谱。本研究在该图谱上定位了WNT/β-连环蛋白信号通路中的一些相关基因，获得了这些基因的基因拷贝数变化信息，综合分析了该信号通路在遗传水平和甲基化状态，即表观遗传学水平上的异常变化。对肝细胞癌中非常重要的WNT/β-连环蛋白信号通路进行了全面的研究。
第2章实验研究.......21
2.1肝细胞癌基因组不稳定，基因突变....23
2 . 1 . 1 WNT/β-连环蛋白信号通路相关基因.......23
2.1.2肿瘤抑制基因突变检测APC，PTEN，TP53.......27
2.1.3讨论........382.1.4总结........40
2.2 wt/β-连环蛋白途径相关基因启动子........41
2.2.1实验材料........41
2.2.2实验方法........41
2.2.3结果........50
2.2.4讨论........58
2.2.5摘要........60
[8]
1。肝癌细胞的基因组具有广泛的基因组不稳定性，多个染色体片段发生异常变化。其中，扩增区常见于染色体1q、5p、5q、6p、7q、8q、17q、20p和20q。杂合性缺失区域常见于1p、4q、6q、8p、9p、13q、14q、16p、16q、17p、18q和21q。
2，WNT/β-连环蛋白信号通路中的六个相关基因(APC、FZD9、SFRP1、SOX17、WIF1和WNT2)在肝癌中异常甲基化。我们以前的实验工作发现，这6个基因的基因拷贝数在肝癌中显著扩增，但根据文献报道，这些基因在肝癌中的表达下调。提示基因异常甲基化在基因沉默中起作用。FZD9、SFRP1、SOX17、WIF1和WNT2的异常甲基化有可能成为肝癌的早期诊断指标之一。
3、AXIN2在肝癌组织、癌旁组织、正常肝组织和外周血中未发现异常甲基化，但在直肠癌、肺癌和其他肿瘤中很常见。
4。在20个肝癌样本中，我们分别检测到1例肿瘤抑制基因APC、PTEN和TP53的体细胞突变，其中在APC和TP53阳性病例中也发现了杂合性缺失，提示APC和TP53异常在肝癌发生和发展中的作用。
5、基因突变、杂合性缺失等在肿瘤进化中具有随机性和个体化特征。很难找到适用于其中所有肿瘤或同类肿瘤的通用标记。然而，也有一些限制。相对而言，异常甲基化是肿瘤中的常见现象。可以开发更广泛应用的肿瘤生物标志物。
参考
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