36562字硕士毕业论文人参内生细菌gel5的抑菌机理及防病效果评价与分析。

论文类型：硕士毕业论文

论文字数：36562字

论点：人参,病原菌,菌株

论文概述：

本文是药学论文，主要论述人参体内分离出来的内生拮抗细菌为研究对象，在内生细菌的分离，拮抗细菌的筛选、鉴定的基础上，研究其抑菌机理和田间的防效评价。

论文正文：

第一章文献综述

1人参概述
人参是五加科人参属药用植物，目前主要分布于中国长白山地区、朝鲜半岛和俄罗斯远东地区[1]。《神农白草经》是我国现存最早的药理学专著，详细论述了人参的药用价值。长期服用人参可以强身健体、益智明目、安神止惊、延年益寿。由于其神奇而广泛的功能，它享有“白草之王”[2的美誉。目前，人参栽培主要依靠人工栽培。栽培模式分为园林人参栽培、森林人参栽培和非森林栽培[3.5]。栽培技术基本相同。栽培技术均基于野生人参的生长环境和习性，并根据园林、林地和非林地的实际环境特征进行调整。
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2人参病害及其危害
人参从野生到人工栽培后，病害逐年增加，导致人参产量和品质下降，成为困扰人参产业发展的突出问题。据国内外报道，人参上有50多种传染病和非传染病，中国已报道30多种。从20世纪50年代中后期至今的40年间，人参病害的发生、分布和危害、病原类型、发生规律、预测预报、综合防治等方面的研究在理论和实践上都取得了明显进展，在生产防治方面发挥了积极作用，使我国人参病害防治研究处于世界先进行列。
土传疾病是人参的主要传染病之一。引起人参土传病害的病原菌种类繁多，国内外记录的主要有柱锈菌、疫霉、镰孢菌属(Fusarium TO/am’)、人参属(Altemariapanax)、赛克罗替尼帕纳(Seclerotiniapanax)、茄尼丝核菌(Mhizoctonia solani)等。上述病原菌大多在土壤中繁殖和传播，不同地区的栽培管理方法和土壤环境不同，土传病原菌的优势菌群也会不同。
土传病原体通常从植物根部或莲藕根部感染作物，从而导致疾病。人参根腐病包括锈病、菌核病、流行病、根腐病、黑腐病、黑茎腐病、灰霉病、细菌性根腐病等。莲藕病害主要包括猝倒、猝倒、枯萎病、黑斑病等。叶部病害主要包括黑斑病、流行性病害、炭疽病、白粉病、诱发性病害等。果实和种子病害主要包括黑斑病和白粉病[9]。
其中，最严重的疾病如下:
①人参锈病
目前，已报道5种致病病原体:柱锈菌(Zinns)。斯克尔顿，圆柱形汽车公司(希尔德)。)，cylindrocarpon panacci cola(zinn s .)赵等人，罗布斯塔·希尔德圆柱形。、以及圆柱形参和宫泽。该病原体可感染人参根、莲藕和不同年龄的孢子。在疾病开始时，人参根的表皮显示出小的黄色锈斑，这些锈斑从浅到深逐渐扩展和融合。最后，病斑形状接近圆形、椭圆形或不规则，呈铁锈色，边缘稍凸起，中心稍凹陷，与健康部位有明显的边界。刺绣腐烂是人参根部的一种常见疾病。从早春到深秋，它能感染人参根。它发生在所有一年生人参根部，发病率为30%。40%，情节严重的发生率可达70%以上。人参根部病害造成人参产量严重下降，人参产量和质量严重下降，给人参产业生产造成重大经济损失。
②人参猝倒病
猝倒病的病原是立枯丝核菌。主要发病部位位于地表以下的幼苗莲基部，在距地表3~5 cm的干湿土壤交界处。莲座的患病部位开始呈现黄褐色的小斑点，然后扩展成凹陷的长斑点，逐渐渗入莲座中，使患病的莲座收缩软化，使人参荷叶枯萎，成片死亡。这种疾病广泛传播。它是人参苗期的主要病害之一。主要感染幼苗1~2年。植物平均受害率在20%以上，情节严重的可达50%，造成人参苗成片死亡，损失巨大。
③人参扑杀病
猝倒病由腐霉引起，主要危害两岁以内的人参幼苗。它开始从靠近地面的幼莲基部感染人参幼苗，患病部分收缩和软化，直到整个植株倒伏和死亡。该病是人参苗期常见的多发病之一，严重时可导致人参苗死亡。
④人参黑斑病的病原是人参黑斑病。)，主要损害叶子、莲花、花梗、果实等。该病是危害人参地上部分最严重的疾病之一，发病率最高，损失最大。发病率从20%到30%不等，在严重病例中达到80%以上。中国人参的种植不受黑斑病的困扰。当降雨量和空空气湿度合适时，黑斑病会迅速发生，并可能在很短的时间内广泛传播。当黑斑病感染叶和茎时，它导致早期落叶，导致人参种子和根产量低和质量差。当它感染花梗和果实时，它导致花序死亡，果实和种子干燥，而当它严重时，它导致种子丢失。
⑤人参疫病
病原为仙人掌疫霉。et coh。)schroet。)具有白色菌丝体和棉絮，主要损害叶子、叶柄、莲藕和人参根。受损的植物在开始时是褐色的、浸满水的和无边界的病斑，出现在嫩莲或叶柄上，并且发生在整个生长期。温度和湿度是影响疾病发生的主要因素。该病是人参成年期的严重病害之一，也称为湿腐病。在我国主要人参产区，植物受害率一般为10%~20%，严重程度可达50%以上，流行期间损失惨重。
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第二章人参内生细菌的分离鉴定及拮抗菌

人参作为重要药用植物，其病害是影响人参产量和品质的关键因素之一。传统方法主要是通过化学农药和田间管理进行防治。化学农药虽然具有明显的防治效果，但很难解决病原菌耐药性和环境污染问题。目前，生物防治已成为药用植物病害防治研究的热点。通过研究木霉对油菜黄单胞菌根腐病病原菌的拮抗作用和盆栽油菜黄单胞菌根腐病的防治，发现三种木霉制剂对防治油菜黄单胞菌根腐病均有显著效果。然而，木霉等一些生物防治细菌易受外界环境因素的干扰，对植物病害的防治效果不稳定。内生细菌生活在植物中，其生存环境相对稳定。如果能从中找到生防菌株，将有助于解决现有生防细菌病害防治效果不稳定的问题。迄今为止，我国对人参内生细菌进行了大量研究。邱付斌等[24]分离鉴定人参内生细菌。姜竹[从人参根中分离内生细菌，并对其抑菌物质进行了研究。本章从新鲜健康人参根中分离纯化内生细菌，通过对峙培养观察不同内生细菌对人参病原菌生长的影响。从蹄类植物中筛选出对人参病原菌具有拮抗作用的内生细菌，采用l6SrDNA和形态学观察方法进行鉴定，确定拮抗内生细菌的种类。

1试验材料
1.1试验材料
试验植物材料为吉林省抚松县人参生产基地的健康人参。测试的人参病原菌包括人参锈菌Cyli/tdrocarpon析构菌、人参疫霉、人参黑斑病菌Atermrrfapanax，这些都是由研究组保藏的。
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2试验方法
2.1内生细菌的鉴定
2.1.1分子鉴定
细菌的分子鉴定方法。16S rDNA序列分析:将适量细菌放入无菌水中，充分摇匀成菌悬液，对单个菌落的16SrDNA进行聚合酶链反应扩增。引物fdl(5 \'-agagttgtccctgctag-3 \')和rpl (5\'-acgtaccttgttacgactt-3 \')扩增细菌的16S rDNA。扩增系统为25个，包括lOOmmol。L-iTris，500 mmol l-1kcl 20 mmol-l-1 mg-1，ph 8.3) 2.5 il，Taq脱氧核糖核酸聚合酶(2.5 )1 nl，引物(2)各1 nl，脱氧核糖核酸(2.5 mmol-L-1)1模板脱氧核糖核酸(细菌悬液)1 l，其余用再蒸馏水补充。扩增程序为94。C5分钟；94 cimin，55°c 1分钟，72 v 1分钟，30次循环；最后，72°C延长了lOmin。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增产物的测序结果与NCBI细菌数据库进行同源性比较。比较结果用于构建系统发育树，并进一步鉴定同源细菌。
2.1.2形态观察
1)菌落形态
当纯化培养物中出现单个菌落时，观察其菌落形态特征，包括其形状、大小、边缘、表面、凸起形状、透明度、湿润或干燥、光滑或粗糖、菌落和培养基颜色等。
2)革兰氏染色
固定生长在LB培养基中拮抗细菌涂片8-12小时，首先用结晶紫染色1分钟，用水洗涤，用碘溶液处理亚胺，用水洗涤，用95%乙醇脱色30秒，用水洗涤，用番红复染亚胺，用水洗涤，显微镜检查。阳性细菌被染成紫色，而阴性细菌被染成红色。
3)孢子染色
使用孔雀石绿染色法。拿起抗菌涂片后，用饱和孔雀石绿溶液染色10分钟，并用自来水冲洗。用碱性品红溶液复染30秒；；用水洗涤，抽吸干燥；显微镜检查。孢子是绿色的，菌体和孢子囊是红色的。
4)鞭毛染色
在载玻片上滴一滴蒸馏水，将细菌苔藓涂在蒸馏水上，将载玻片倾斜到另一端，并平放干燥。洛敏用液体甲染色，用蒸馏水洗涤，用液体乙洗涤，用液体B 30染色？60s，加热，冷却，用蒸汽冲洗，显微镜检查。菌体是深棕色的，鞭毛是棕色的，[67]。
5)电镜观察
收集10毫升内生细菌溶液，离心10毫升，5000毫升\' 2分钟，弃去上清液。将细胞重悬于10毫升PBS缓冲液中，离心，重悬于1毫升2.5%戊二酸中，在4℃下过夜，离心弃去上清液。用1毫升PBS缓冲液洗涤漆细胞沉淀物3次，离心前在室温下摇动15分钟，弃去上清液。细胞沉淀物分别用1毫升50%、60%、70%、80%、90%和100%乙醇洗涤，离心前在室温下放置10分钟。用1毫升叔丁醇洗涤细胞，并静置过夜。细胞均匀地涂在载玻片上。超快真空空用于冻结和挥发叔丁醇，并喷洒金以观察[68]。
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第三章内生细菌gel5的抗菌机制.........................................24
1 1试验材料.........................................24
1.1测试材料.........................................24
1.2中等.........................................24
1.3主要仪器和试剂.........................................25
2测试方法.........................................25
2.1拮抗菌株对人参病原菌生长的影响.........................................25
2.2拮抗菌活性的检测.........................................26
2.3数据分析.........................................27
3结果和分析.........................................28
3.1拮抗菌株对人参病原菌生长的影响.........................................28
3.2 Gel 5菌株提取物的抗菌活性.........................................30
4讨论.........................................33
第四章人参内生细菌gel5的动态及根区土壤..............................35
1测试材料.........................................35
1.1测试材料.........................................35
1.2中等.........................................35
1.3主要仪器和试剂.........................................36
2测试方法.........................................36
2.1菌株标记.........................................36[/br/ ]2.2菌株生长和衰退的动态测定.........................................37
2.3数据分析.........................................37
3结果和分析.........................................37[/溴/]3.1内生菌株gel5的抗生素菌株标记.........................................37
3.2人参内生细菌的动态.........................................38
3.3根区土壤内生菌株消长动态.........................................39
3.4回收菌株的抗菌活性.........................................39
4第五章讨论内生细菌gel5的田间防治效果试验.........................................40

人参药用植物具有多年生生长习性(通常在5-6年内收获)，也就是说，当种植在新的森林土壤中时，植物生长会减弱，后期的产量、品质和抗病性会降低。目前，一些针对人参病害研究的生防细菌易受外界条件的影响，长期难以在与土壤和植物根际细菌和微生物的竞争中占据优势，从而极大地影响了它们的实用价值。然而，植物内生细菌存在于植物本身，容易占据有利的生态位。它们能够抵抗植物自身的防御反应，并直接与病原菌相互作用。与传统方法相比，生物防治效果受环境影响较小，更加稳定。前期工作表明，内生抗菌凝胶5对人参病原菌孢子和菌丝的生长有一定的抑制作用。国内外对内生细菌的研究大多集中在实验室对蹄选择和抑菌机理的研究阶段。内生细菌作为生防菌的田间防治效果研究较少，应用于田间的生防菌尚未释放。然而，为了生物防治细菌的田间防治效果，Thangave等人[121]从土壤中分离出了一株介体哈茨木霉(ElectrichodErmaharzianum)菌株。通过离体和田间试验，发现该菌株对香蕉枯萎病的防治效果优于多菌灵。本章通过田间试验研究了内生细菌抬升对人参种子出苗和人参幼苗成活率的影响。通过出苗率和成活率的计算，研究了内生细菌作为田间生防菌的防病效果。本研究组分离并保存了
1试验材料
1.1试验材料
人参内生细菌gel5菌株。人参种子和幼苗(两年生)购自吉林省抚松县人参生产基地。
1.2培养基
LB液体培养基:蛋白胨10.0 g，氯化钠。Og，蒸水1升，ph7.0。
磅固体培养基:蛋白胨10.0克，氯化钠。Og，琼脂粉15.0克，蒸馏水1升，pH7.0.
1.3主要仪器试剂
恒温培养振荡器(ZHWY-100H，上海智诚分析仪器有限公司
电动恒温培养箱(DH6000，泰斯特)
洁净工作台(SW-CJ-ID，苏州净化)
立式自动电动压力蒸汽灭菌器(LX-B5L型，合肥华泰医疗有限公司)[/br从48小时LB培养基中选择一环gel5菌株并接种到100毫升LB液体培养基中，在振荡中培养3(rC，150 rmin-I)24小时，用分光光度计从该菌株的发酵液中测量ODsoo。根据标准曲线计算发酵液的浓度，然后将发酵液稀释至108cfirmri细菌悬液以备后用。
2.2田间试验
2.2.1田间设计
试验场地位于北京药用植物研究所试验场地南部人参遮荫棚内。试验所用土壤为吉林抚松人参种植基地的老参土和新林地。测试从2013年5月1日持续到7月10日。
人参幼苗和种子分别在108种菌悬液中浸泡30分钟，取出后分别播种或移栽到盛有老参土和新林地的花盆中。人参种子用于出苗率试验。他们被播种在一个15厘米的花盆里，每盆有10颗种子。人参幼苗用于幼苗成活率试验，并移植到0)25厘米花盆中，每盆10个幼苗。另一个处理组用50%多菌灵稀释300-400倍浸泡人参种子和幼苗。每次处理种植10个花盆，所有花盆放置在遮荫棚中进行栽培和统一田间管理，对照组用清水浸泡人参种子和幼苗。
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[概述/br/]
本研究以人参内生拮抗细菌为研究对象。在内生细菌分离的基础上，对拮抗细菌的筛选鉴定、抑菌机理及田间防治效果评价进行了研究。具体结论如下:
1。从两年生人参中分离到40株内生细菌。通过对峙培养，筛选出对人参病原菌具有拮抗作用的拮抗菌株gel5。通过16S rDNA同源性分析和显微观察，初步鉴定gel5属于寡营养单胞菌。经过NCBI多序列比对和系统发育树构建及其生理生化测定，发现gel5与立枯丝核菌同源性最高(97%)，很可能是一个潜在的新种。
2。对拮抗菌株gel5和人参病原菌进行了对抗试验，与对照组相比，抑制带明显，抑制效果明显。对对峙培养的病原菌进行显微观察，发现病原菌菌丝扭曲生长，菌丝表面不均匀，有肿瘤样突起。病原菌孢子形成明显减少，不能正常萌发。gel5菌株发酵液上清液对致病菌有明显的抑制作用。在上清液中活性物质的粗提后，发现粗蛋白提取物、粗脂肽提取物和有机溶剂提取的小分子代谢物均具有不同程度的拮抗作用，这表明菌株gel5胞外分泌物中的抗菌活性成分不是单一的，可能是多种活性物质的协同抗菌作用。
3。用抗生素标记拮抗菌株灌溉人参幼苗，研究gel5在人参体内和根区土壤中的生长和下降动态。结果表明，gel5能在人参体内和根区土壤中定植一段时间。对回收的标记菌株和病原菌进行对抗培养，发现其仍具有抗菌作用，表明拮抗菌株gel5具有稳定的抗菌作用。
4。田间病害防治试验结果表明，拮抗菌gel5和多菌灵对人参病害的防治效果与对照相同。然而，如果将gel5作为生物防治菌应用于该领域，它具有无毒、无污染等优点，是一种具有良好应用潜力的生物防治菌。
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参考资料(略)