40000字硕士毕业论文红树林土壤宏基因组数据库中新葡萄糖苷酶的筛选及其酶学特性分析

论文类型：硕士毕业论文

论文字数：40000字

论点：糖苷酶,纤维素,葡萄

论文概述：

目前常规的克隆 β-葡萄糖苷酶基因的策略多利用分子生物学技术从可培养的微生物（绝大部分是真菌）中获得，利用宏基因组技术从未培养微生物中寻找新型 β-葡萄糖苷酶基因的研究目前仅有

论文正文：

第一章前言

1.1β-葡萄糖苷酶研究概述
纤维素是由吡喃型D-葡萄糖与β-1，4-糖苷键连接而成的线性高分子(如图所示)。分子式为(C6H10O5)n，不溶于水和普通有机溶剂。由于β-1，4-糖苷键的特殊构象，纤维素分子内部和之间可以形成大量氢键。分子内氢键赋予分子刚性，而分子间氢键的有序排列可以形成纤维素的结晶区域。这也是纤维素不同于其他多糖的一个重要特征。在天然纤维素中，纤维素分子一般嵌入或嵌入半纤维素和木质素中，形成复杂的网络结构
植物通常含有35-50%的纤维素(以干物质为基础计算)，因此纤维素是地球上分布最广、最丰富的可再生资源。中国有丰富的生物质资源。每年可利用的生物质原料资源总量相当于11.71亿吨标准煤。如果用一年生稻草来开发生物能源，它可以相当于三峡八座水电站的发电量。纤维素可广泛用于生产生物乙醇和其他产品。因为纤维素含有由β-1，4-糖苷键连接的葡萄糖亚单位，所以它可以水解成可发酵的糖。目前，巴西拥有世界上最大的燃料酒精年产量。它以甘蔗为原料，采用快速水解法(DHR法)生产酒精的最新技术已得到认可。
大多数国家使用粮食作物生产燃料酒精，例如美国，它使用玉米生产燃料酒精。然而，淀粉原料的使用不仅成本高昂，而且不利于全球粮食危机背景下的长期发展。燃料酒精作为一种可再生能源，在缓解能源危机中发挥着重要作用。作为一种国家能源战略选择，世界上许多国家都对此进行了深入研究。如果能通过有效的技术降解纤维素，不仅可以降低生物能源的生产成本，还可以减少对石油等不可再生能源的依赖，这是解决全球能源供应的有效途径。

[/BR/]1 . 1 . 2β-葡萄糖苷酶简介
β-葡萄糖苷酶是一种纤维素酶，可将纤维二糖和可溶性纤维低聚糖水解成葡萄糖分子和相应的配体。根据底物特异性，可分为烃基β-葡萄糖苷酶和葡萄糖苷酶。根据它们不同的基因序列，可以分为β-葡萄糖苷酶A和β-葡萄糖苷酶B。β-葡萄糖苷酶作为纤维素酶组分中不可缺少的一部分，在纤维素降解中起着关键作用。自1837年李比希和韦勒首次在苦杏仁汁中发现β-葡萄糖苷酶以来，研究人员在细菌、真菌、霉菌、酵母和植物等中发现了β-葡萄糖苷酶。目前，大多数研究是针对真菌产生的β-葡萄糖苷酶，而应用最广泛的产纤维素酶菌株大多是里氏木霉的优良突变体。这些菌株在纤维素利用过程中容易引起纤维二糖积累的反馈抑制，不利于纤维素降解。因此，提高纤维素酶体系中β-葡萄糖苷酶的活性是提高纤维素水解效率和葡萄糖产量的关键措施。

1 . 1 . 3β-葡萄糖苷酶的应用

[/BR/]1.1.3.1β-葡萄糖苷酶在食品工业中的应用
β-葡萄糖苷酶作为食品调味剂，可以与阿拉伯糖苷酶和鼠李糖苷酶等风味酶协同作用，促进挥发性苷元的释放，从而起到增香作用。研究发现黑曲霉β-葡萄糖苷酶对茶汁、苹果汁等具有良好的增香效果，经该酶处理后的果汁香气更加浓郁，口感更加醇厚。陶萍的研究发现，β-葡萄糖苷酶可以分解青梅中的苦杏仁苷作为脱苦剂，从而降低青梅的苦味。因此，它经常被用作青梅、橄榄等的脱苦剂。此外，β-葡萄糖苷酶可用于生产低聚龙胆糖，其可防止食物中的淀粉老化并保持食物中的水分。

第二章红树林土壤宏基因组文库的构建及β-葡萄糖苷酶基因的筛选

2.1简介
纤维素被公认为世界上最丰富的可再生能源生产原料。β-葡萄糖苷酶在纤维素降解中起着重要作用。β-葡萄糖苷酶能以葡萄糖的形式降解纤维二糖和寡糖，其活性直接影响纤维素的降解效率。该酶在农业、食品、造纸、能源等行业有很大的应用前景。自1837年韦勒和李比希首次在苦杏仁汁中发现β-葡萄糖苷酶以来，这种酶先后在植物、微生物和动物中被发现。虽然酶的来源相对广泛，但仍存在酶活性低、成本高、限制大规模工业化生产和应用等问题。宏基因组学技术克服了传统微生物培养的瓶颈，以环境中微生物群落基因组为研究对象，从分子水平直接研究微生物基因片段，在获得具有特殊功能的新生物活性物质方面具有广阔的应用前景。红树林的大量未培养微生物中含有丰富的β-葡萄糖苷酶资源。因此，本章提出直接提取法从珠海淇澳岛红树林污泥样品中提取基因组DNA，并利用pUC118载体构建宏基因组文库。然后利用基于功能的高通量筛选方法从文库中筛选β-葡萄糖苷酶基因。

第三章β-葡萄糖苷酶的原核表达………… 3.2.2质粒和菌株41 [/BR/] 3.2.3酶和试剂盒41 [/BR/] 3.3试验方法42-52 [/BR/] 3.3.1制备

结论

(1)本文采用直接提取法从红树林土壤样品中直接提取总基因组DNA，并选择pUC118载体成功构建红树林土壤基因组文库。通过高通量筛选方法从文库中筛选出β-葡萄糖苷酶基因。用BLAST软件进行同源性分析，结果表明该基因与GenBank中来自森氏肠杆菌LMG 25706菌株的β-葡萄糖苷酶同源性最高，相似度为84%。该基因片段总长度为1392bp，编码463个氨基酸，预测分子量为52KDa。
(2)利用大肠杆菌原核表达系统诱导基因表达并优化表达条件。该基因与pET-32a(+)表达载体相连，并转移到表达菌株大肠杆菌BL21 (DE3)中。优化了重组酶的表达条件。结果表明，当诱导前细胞浓度OD600=0.8时，最终浓度为1.1mM·IPTG，重组酶在30℃诱导14 h，此时重组酶的表达量最高。
(3)研究了重组酶的酶学性质。以4-硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)为底物时，酶的最适反应温度为51℃，最适pH为6.4，Km值为0.408，Vmax值为444微米/min。在1 mM浓度下，不同金属离子对酶活性的影响如下:Fe2+、Mg2+、Mn2+、Na+对酶活性有促进作用，其中Mg2+对酶活性有最强的促进作用，Zn2+、Ca2+、K+、Cu2+对酶活性有抑制作用，其中Cu2+和Zn2+的抑制作用最明显，Li+和Co2+对酶活性几乎没有影响，而Hg2+对酶活性有完全的抑制作用。不同化合物对酶的影响如下:乙二胺四乙酸和十二烷基硫酸钠对酶有很强的抑制作用，无论浓度是1mM还是100 mM，乙二胺四乙酸的抑制作用最强。尿素和咪唑在浓度为1 mM时对酶活性有很强的促进作用，但当浓度达到100mM时，尿素的促进作用消失，而咪唑对酶活性有抑制作用。无论丙酮的浓度是1mM还是100 mM，酶的活性基本不受影响，酶表现出很强的丙酮耐受性。