37200字硕士毕业论文鸡传染性支气管炎S1基因和M基因双价核酸疫苗的建立及其免疫效果研究
论文类型：硕士毕业论文
论文字数：37200字
论点：雏鸡,病毒,淋巴细胞
论文概述：
本实验将IBV S1与IBVM基因通过一段linker拼接并与真核表达质粒pVAX相连，制备真核二价核酸疫苗。在体外实验中，融合基因在细胞内表达后可以被IBV全病毒粒子多克隆抗体和S1，M各自的蛋白单克隆
论文正文：
1.前言
1.1鸡传染性支气管炎的研究进展
IBV是属于(3)⑶伊多病毒目、冠状病毒科和冠状病毒属第三类鸟类冠状病毒的代表性菌株。冠状病毒是一种主要病原体，可导致人类和动物的呼吸道和消化道疾病。在核糖核酸病毒中，冠状病毒成员的体积最大。这是第一次发现冠状病毒。根据遗传和血清学差异，冠状病毒属分为三组。第三组包括鸡传染性支气管炎病毒、火鸡冠状病毒和新分离的鹳冠状病毒、鸭冠状病毒和雉鸡冠状病毒？。传染性支气管炎病毒、火鸡冠状病毒和至少9种其他哺乳动物冠状病毒属于冠状病毒属。火鸡冠状病毒在蛋白质序列和抗原性上接近哺乳动物冠状病毒，传染性支气管炎病毒与它们有很大不同(1)。
[/br
1.1.1 IBV形态结构
传染性支气管炎病毒有多种形式，但通常为球形，有包膜，直径为80纳米至120纳米，是非分段的单链正链核糖核酸病毒。IBV病毒颗粒主要由胶囊和核衣壳组成。包膜位于病毒的最外层，来源于宿主细胞内膜(高尔基膜或粗面内质网膜)。IBV核衣壳是螺旋对称的，由正链基因组核糖核酸和核衣壳蛋白组成。将从鸡胚培养物中获得的含病毒尿囊液置于4 C18小时。阴性染色后，在电子显微镜下观察。可以观察到大量病态纤维变性过程的脱屑。从自然破裂的病毒颗粒中释放的核蛋白结构(RNP)可以通过射线照相术看到。在大多数情况下，只能看到直径为1-2纳米的链状RNP，偶尔也可以看到直径为10-15纳米的环状结构。
2材料和方法
2。1试验材料
IBVBEADETTE菌株保存在我们的实验室。ffiVM41菌株由东北农业大学传染病系的魏平老师捐赠。含103_5EID5()/羽的传染性支气管炎病毒弱毒H120株，购自哈尔滨制药集团生物疫苗有限公司
2.1.2试验
从哈尔滨的一个养鸡场购买了200只一日龄雄性小鸡。
2。1.3个载体、质粒、细胞株和菌株
pVAX真核表达载体保存在本实验室。动物医学研究所李广兴教授捐赠了多克隆抗体3.1-IBV S和彼得-30a-IBV M基因质粒。Vero细胞和BHK细胞，感受态大肠杆菌菌株JM109和罗塞塔。
2.1.4主要抗体、工具酶和分子生物学试剂盒
FITC标记的山羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG；兔抗IBV全病毒多克隆抗体、兔抗IBVS1蛋白多克隆抗体、兔抗ffiVM蛋白多克隆抗体、小鼠抗鸡CD8+T细胞(FITC)和CD4+T细胞(FITC)单克隆抗体由动物医学院李广兴教授捐赠。标签脱氧核糖核酸聚合酶，T4脱氧核糖核酸连接酶，Sal，EcoR限制性内切酶；小剂量质粒提取试剂盒和脱氧核糖核酸标记DL2000购自TaKaRa生化试剂公司。脱氧核糖核酸凝胶回收纯化试剂盒购自BATTECH生物技术有限公司2.1.5主要生化试剂脂多糖(大肠杆菌脂多糖055:B5；脂多糖(LPS)、刀豆氨酸(Con A)、四甲基偶氮盐(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均购自西格玛试剂公司。Tris、二甲基亚砜和乙二胺四乙酸是从阿姆雷斯科公司购买的。胎牛血清购自元亨金马生物技术发展有限公司；淋巴细胞分离液购自天津浩阳生物制品技术有限公司，RPMI培养基1640、DMEM细胞培养液和G418购自GIBCO公司。PEG8000、NaCK LiCK MgC^、琼脂粉、蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、异丙醇、丙酮、冰醋酸、三氯甲烷、乙醇、磷酸二氢钠等生化试剂均为国内分析纯。
2。1.6主要实验仪器和设备
聚合酶链反应放大器(基因扩增聚合酶链反应系统2400，珀金-埃尔默公司)；实时PGR放大器(rotargent 3000，QIAGEN公司)；高速冷冻离心机(J2-21 M，美国西格玛公司)；流式细胞仪(BECKMEN COULTER，美国)；炎症光学显微镜(尼康公司，日本)；二氧化碳培养箱(立康公司)；紫外分光光度计(3000，PHARMACIA生物技术公司)；凝胶成像仪(1) vp-800，uitra-violet products limited Cambridge uk)；；徕卡应用套件，一种用于图像采集系统的软件(德国加利福尼亚州勒)；空气浴振荡器(哈尔滨东联电子有限公司HZQ-C)；水平电泳槽和电泳仪(DYYIIM1，北京61仪器厂)。
3测试结果.........30-51
3.1 IBV M基因和IBV S1 M融合基因的亚克隆........30-34
3.3鸡外周血和免疫器官中淋巴细胞的增殖........36-44
3.3.1鸡血T淋巴细胞增殖的动态变化........36-37 [/BR/] 3.3.2鸡血B淋巴细胞增殖的动态变化........37-39 [/BR/] 3.3.3鸡胸腺淋巴细胞增殖的动态变化........39-40[/溴/] 3.3.4鸡胸腺B淋巴细胞增殖的动态变化........40-41 [/BR/] 3.3.5鸡脾脏T淋巴细胞增殖的动态变化........41-43 [/BR/] 3.3.6鸡脾脏B淋巴细胞增殖的动态变化........43-44[/溴/] 3.4鸡外周血及免疫器官CD4+和CD8+淋巴细胞抗IBV抗体含量的动态变化........44-48[/溴/] 3.5中和抗体........48-49
3.6........49 [/BR/] 3.7保护率计算结果........49-51
4讨论........51-58
4.1真核重组质粒的构建及免疫设计........51
4.2真核表达载体及融合蛋白的选择........51-52
4.3融合基因真核表达载体体外鸡核酸免疫的探讨与分析........52-53[/比尔/] 4.4........53[/比尔/] 4.5鸡免疫后淋巴细胞增殖功能的变化........53-55[/比尔/] 4.6免疫后鸡不同亚型T细胞的动态变化........55-56[/溴/] 4.7外周血抗IBV IgG抗体含量的动态变化........56-57 [/BR/] 4.8病毒攻击试验鸡后保护率的计算结果........57[/比尔/] 4.9免疫效果的比较分析........57-58
结论
1。融合基因质粒PVax-IBVSI-接头-M0·
2。融合的Ibvsi和M基因可以在体外表达。
3。用IBV·S1和M基因疫苗免疫的鸡可以抵抗IBV感染。
4。IBV S1和M基因联合免疫诱导细胞免疫和体液免疫反应早于IBV M基因单独免疫，具有更好的免疫保护效果。
参考
[1]卡瓦纳博士。七种急性呼吸综合征http://sblunwen.com/jygc/疫苗开发:禽传染性支气管炎冠状病毒疫苗接种经验。鸟类病理学。2003.32:567-582。
[2]刘海杰，李丽海，施伟林，等.传染性支气管炎病毒多重聚合酶链反应检测及序列分析。病毒学方法。2003.[109(9):31-37
[3]戴维斯·海勒，维伦·格雷戈，德梅内克斯·布莱纳，1993年。基因在体内直接转移到骨骼肌，影响转移效率和表达稳定性的因素。哼吉恩·瑟。(4):151-159。
[4]伊格纳托维奇，萨帕茨S .鸡传染性支气管炎病毒S蛋白和Np蛋白上先前未知抗原表位的鉴定[J]。Arch Virol，2005.150 (9): 1813-1831。
[5]隆托克，科尔塞，马查迈尔·查梅.细胞内靶向信号有助于冠状病毒尖峰蛋白在病毒装配位点附近的定位[.《病毒学》，2004.78 (11): 5913-5922。
[6]杨叶民。2006.IBV结构蛋白基因[的克隆、表达及应用研究。南昌大学硕士论文。
[7]胡金强，蔡月琴。李亦非等人，2007年。传染性支气管炎病毒S1蛋白在Vero细胞中的表达和分布。中国兽医杂志。27 (4): 437-440。[/比尔/] [8]王x，施尼兹林·威姆，特里帕蒂·丹。[6]等.含有马萨诸塞41株传染性支气管炎病毒[株免疫原性基因的禽痘病毒的构建及免疫原性研究.鸟类分布图，2002。46 (4): 831-838。一种表达传染性支气管炎病毒SIgene的重组禽腺病毒，可抵御传染性支气管炎病毒的攻击。疫苗，2003.21 (21-22): 2730-2736。
[10]周俊英，程立奎，郑晓军，等.表达传染性支气管炎病毒全长穗状蛋白的转基因马铃薯的产生[[]。Biotechnol，2004年。生病:121-130。