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37200字硕士毕业论文鸡传染性支气管炎S1基因和M基因双价核酸疫苗的建立及其免疫效果研究

论文类型:硕士毕业论文
论文字数:37200字
论点:雏鸡,病毒,淋巴细胞
论文概述:

本实验将IBV S1与IBVM基因通过一段linker拼接并与真核表达质粒pVAX相连,制备真核二价核酸疫苗。在体外实验中,融合基因在细胞内表达后可以被IBV全病毒粒子多克隆抗体和S1,M各自的蛋白单克隆

论文正文:

1.前言

1.1鸡传染性支气管炎的研究进展
IBV是属于(3)⑶伊多病毒目、冠状病毒科和冠状病毒属第三类鸟类冠状病毒的代表性菌株。冠状病毒是一种主要病原体,可导致人类和动物的呼吸道和消化道疾病。在核糖核酸病毒中,冠状病毒成员的体积最大。这是第一次发现冠状病毒。根据遗传和血清学差异,冠状病毒属分为三组。第三组包括鸡传染性支气管炎病毒、火鸡冠状病毒和新分离的鹳冠状病毒、鸭冠状病毒和雉鸡冠状病毒?。传染性支气管炎病毒、火鸡冠状病毒和至少9种其他哺乳动物冠状病毒属于冠状病毒属。火鸡冠状病毒在蛋白质序列和抗原性上接近哺乳动物冠状病毒,传染性支气管炎病毒与它们有很大不同(1)。

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1.1.1 IBV形态结构
传染性支气管炎病毒有多种形式,但通常为球形,有包膜,直径为80纳米至120纳米,是非分段的单链正链核糖核酸病毒。IBV病毒颗粒主要由胶囊和核衣壳组成。包膜位于病毒的最外层,来源于宿主细胞内膜(高尔基膜或粗面内质网膜)。IBV核衣壳是螺旋对称的,由正链基因组核糖核酸和核衣壳蛋白组成。将从鸡胚培养物中获得的含病毒尿囊液置于4 C18小时。阴性染色后,在电子显微镜下观察。可以观察到大量病态纤维变性过程的脱屑。从自然破裂的病毒颗粒中释放的核蛋白结构(RNP)可以通过射线照相术看到。在大多数情况下,只能看到直径为1-2纳米的链状RNP,偶尔也可以看到直径为10-15纳米的环状结构。

2材料和方法

2。1试验材料
IBVBEADETTE菌株保存在我们的实验室。ffiVM41菌株由东北农业大学传染病系的魏平老师捐赠。含103_5EID5()/羽的传染性支气管炎病毒弱毒H120株,购自哈尔滨制药集团生物疫苗有限公司

2.1.2试验
从哈尔滨的一个养鸡场购买了200只一日龄雄性小鸡。

2。1.3个载体、质粒、细胞株和菌株
pVAX真核表达载体保存在本实验室。动物医学研究所李广兴教授捐赠了多克隆抗体3.1-IBV S和彼得-30a-IBV M基因质粒。Vero细胞和BHK细胞,感受态大肠杆菌菌株JM109和罗塞塔。

2.1.4主要抗体、工具酶和分子生物学试剂盒
FITC标记的山羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG;兔抗IBV全病毒多克隆抗体、兔抗IBVS1蛋白多克隆抗体、兔抗ffiVM蛋白多克隆抗体、小鼠抗鸡CD8+T细胞(FITC)和CD4+T细胞(FITC)单克隆抗体由动物医学院李广兴教授捐赠。标签脱氧核糖核酸聚合酶,T4脱氧核糖核酸连接酶,Sal,EcoR限制性内切酶;小剂量质粒提取试剂盒和脱氧核糖核酸标记DL2000购自TaKaRa生化试剂公司。脱氧核糖核酸凝胶回收纯化试剂盒购自BATTECH生物技术有限公司2.1.5主要生化试剂脂多糖(大肠杆菌脂多糖055:B5;脂多糖(LPS)、刀豆氨酸(Con A)、四甲基偶氮盐(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均购自西格玛试剂公司。Tris、二甲基亚砜和乙二胺四乙酸是从阿姆雷斯科公司购买的。胎牛血清购自元亨金马生物技术发展有限公司;淋巴细胞分离液购自天津浩阳生物制品技术有限公司,RPMI培养基1640、DMEM细胞培养液和G418购自GIBCO公司。PEG8000、NaCK LiCK MgC^、琼脂粉、蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、异丙醇、丙酮、冰醋酸、三氯甲烷、乙醇、磷酸二氢钠等生化试剂均为国内分析纯。

2。1.6主要实验仪器和设备
聚合酶链反应放大器(基因扩增聚合酶链反应系统2400,珀金-埃尔默公司);实时PGR放大器(rotargent 3000,QIAGEN公司);高速冷冻离心机(J2-21 M,美国西格玛公司);流式细胞仪(BECKMEN COULTER,美国);炎症光学显微镜(尼康公司,日本);二氧化碳培养箱(立康公司);紫外分光光度计(3000,PHARMACIA生物技术公司);凝胶成像仪(1) vp-800,uitra-violet products limited Cambridge uk);;徕卡应用套件,一种用于图像采集系统的软件(德国加利福尼亚州勒);空气浴振荡器(哈尔滨东联电子有限公司HZQ-C);水平电泳槽和电泳仪(DYYIIM1,北京61仪器厂)。

3测试结果.........30-51
3.1 IBV M基因和IBV S1 M融合基因的亚克隆........30-34
3.3鸡外周血和免疫器官中淋巴细胞的增殖........36-44
3.3.1鸡血T淋巴细胞增殖的动态变化........36-37 [/BR/] 3.3.2鸡血B淋巴细胞增殖的动态变化........37-39 [/BR/] 3.3.3鸡胸腺淋巴细胞增殖的动态变化........39-40[/溴/] 3.3.4鸡胸腺B淋巴细胞增殖的动态变化........40-41 [/BR/] 3.3.5鸡脾脏T淋巴细胞增殖的动态变化........41-43 [/BR/] 3.3.6鸡脾脏B淋巴细胞增殖的动态变化........43-44[/溴/] 3.4鸡外周血及免疫器官CD4+和CD8+淋巴细胞抗IBV抗体含量的动态变化........44-48[/溴/] 3.5中和抗体........48-49
3.6........49 [/BR/] 3.7保护率计算结果........49-51
4讨论........51-58
4.1真核重组质粒的构建及免疫设计........51
4.2真核表达载体及融合蛋白的选择........51-52
4.3融合基因真核表达载体体外鸡核酸免疫的探讨与分析........52-53[/比尔/] 4.4........53[/比尔/] 4.5鸡免疫后淋巴细胞增殖功能的变化........53-55[/比尔/] 4.6免疫后鸡不同亚型T细胞的动态变化........55-56[/溴/] 4.7外周血抗IBV IgG抗体含量的动态变化........56-57 [/BR/] 4.8病毒攻击试验鸡后保护率的计算结果........57[/比尔/] 4.9免疫效果的比较分析........57-58

结论

1。融合基因质粒PVax-IBVSI-接头-M0·
2。融合的Ibvsi和M基因可以在体外表达。
3。用IBV·S1和M基因疫苗免疫的鸡可以抵抗IBV感染。
4。IBV S1和M基因联合免疫诱导细胞免疫和体液免疫反应早于IBV M基因单独免疫,具有更好的免疫保护效果。

参考
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