36258字硕士毕业论文激光显微镜和质谱蛋白质组学鉴定淀粉样蛋白类型
论文类型：硕士毕业论文
论文字数：36258字
论点：蛋白,标本,淀粉
论文概述：
本文是临床医学论文，我们应用不同裂解液对大鼠各脏器FFPE微切及普通切片标本进行蛋白提取及质谱鉴定，结果显示对于微切标本，含有Zwittergent 3-16的裂解液在鉴定多肽数量、蛋白数量及蛋白
论文正文：
第一部分:福尔马林固定石包埋组织样品蛋白质提取方法的优化
简介
早在1991年就提出了抗原修复的方法(1)，这使得在福尔马林固定的石头错位(FFPE)标本中恢复抗原的免疫活性成为可能，因此免疫组织化学(IHC)成为基于抗原抗体反应获得蛋白质信息的重要实验手段。然而，免疫学方法的成功取决于抗体获取的难度和质量，这通常是耗时和昂贵的。随着现代蛋白质组学方法的出现，获取生物样品中所有蛋白质的信息成为可能，为临床病理诊断带来了新的发展方向。FFPE标本能很好地保存生物组织形态，保存周期长，[2，3]，因此院内病理系统包含丰富的回顾性分析资料。将FFPE标本与质谱蛋白质组学技术相结合，可用于探索不同病理状态下蛋白质表达的差异，已广泛应用于基础肿瘤临床研究领域[4】。然而，长期以来，样品福尔马林固定过程中的蛋白质-核酸、蛋白质-蛋白质共价交联和蛋白质降解在很大程度上阻碍了蛋白质提取
1.2主要试剂
4%多聚甲醛中国，北京定国昌盛生物技术有限公司
水合氯醛中国，北京绿源百德生物技术有限公司
0.9%盐水中国，北京百森泰生物技术有限公司
翠斯美国，诺冯公司PEG20000美国。[英纳科公司/br/]美国两性目标3-16，西格玛公司
钟磊埃特勒内钻石四乙酸(乙二胺四乙酸)，北京格梅诺生物桶压机有限公司[/br/
-美国二硫苏糖醇(DTT)。美国铝业公司
十二烷基硫酸钠(SDS)美国，美国通用串行总线公司
FFPE-FASP蛋白质分析试剂盒美国，美国热电公司
尿素中国，北京贝尔迪生物技术有限公司
硫脲中国，北京贝尔迪生物技术有限公司
查帕斯美国，美国铝业公司
.....。虽然逐步优化的蛋白质提取溶液和提取技术使从FFPE样品中获得蛋白质用于蛋白质组分析更加有效
2实验方法，但是目前还没有国际公认的蛋白质提取策略。如今广泛使用的蛋白质提取物通常由洗涤剂、还原剂、变性剂和盐组成。2010年，Ostasiewicz
2.1大鼠FFPE标本的制备
2.1.1用水合氯醛(5niL/kg)腹膜内麻醉SD大鼠，迅速打开胸腔，暴露心脏，从心脏顶端插入套管针，并将针向上推进升主动脉。取出套管针内芯，连接医用输液器和0.9%生理盐水，打开输液开关，进行快速输液。同时，用剪刀在右心房附件开一个小口，用4%多聚甲醛代替流出液，待无色后再输注。快速灌注50毫升后，减慢速度并保持缓慢滴注。每只大鼠需要大约100毫升的灌注液。
2.1.2灌注完成后，用剪刀从枕骨大孔横切大鼠，用剪刀斜插枕骨大孔以切开卢浮宫骨。止血银用于切断两侧的顶骨。用剪刀将一侧的视神经切断，并探究到底。整个脑组织被抬起并取出。仔细分离并切割大鼠心脏、肝脏、肾脏和肺的周围结构，然后依次取出。
2.1.3所有器官在4℃±4%多聚甲醛中固定过夜，然后脱水、透明并依次上蜡制成FFPE标本。
2.1.4采集大脑、心脏、肺、肾和肝脏的FFPE样本，切割具有厚度的组织并放置在普通载玻片上。在用于激光显微切割(LMD)的特殊聚酯切片上切割另一个6厘米厚的组织。
2.1.5对FFPE组织切片进行脱臼处理:二甲苯洗涤3次，每次5min用100%乙醇冲洗两次，每次3分钟；用90%乙醇冲洗一次，时间为3分钟；用80%乙醇冲洗一次，时间为3分钟；用清水冲洗一次，时间为3分钟。室温下风干。
………。使用含有Tris、DTT和SDS的裂解物从肝组织中提取了155纳克/毫克的蛋白质。2012年，维斯涅夫斯基·
系统性淀粉样变的第二部分激光显微镜检查.........25
导言.........25
实验材料.........26
实验方法.........26
实验结果.........29
讨论.........36
摘要.........40
第三部分文献综述:原发性轻链淀粉样变的治疗进展.........47等人将聚乙二醇20000 (PEG20000)添加到上述方案中，然后成功地从微FFPE样品中提取了10，000多种蛋白质。虽然上述提取液已被证明具有高提取效率，但SDS的存在使其与质谱技术不兼容，因此需要添加复杂的去污剂去除程序。在此基础上，一些研究提出用尿素作为促进剂取代十二烷基硫酸钠，但总的提取效率并不令人满意。梅奥诊所的研究人员通过使用含有两性离子3-16的提取物从淀粉样FFPE显微切片标本中获得蛋白质，并成功鉴定了亚型[/比尔/]2008年，梅奥诊所首次提出由LMD/微软公司鉴定神经组织蛋白质沉积的成分，从而确定疾病的亚型。在5例淀粉样肿瘤中成功鉴定出SAP和限制性轻链表达。致病蛋白在淀粉样变中局部沉积，表达量高于其他蛋白类型。通过显微切割选择病理组织以减少杂质蛋白的干扰，然后通过质谱鉴定组织中所有蛋白的组成，并根据表达丰度确定淀粉样蛋白，从而鉴定疾病亚型。基于这一理论，梅奥通过质谱进一步将淀粉样变性影响的组织分类，如心脏[25%、肾脏[44]和神经。弗拉纳·[25]在50例确诊淀粉样变的患者中重新鉴定了LMD/多发性硬化症亚型，发现LMD/多发性硬化症诊断的准确性和特异性达到100%。然而，在由41例患者心脏标本组成的验证组中，分型成功率达到98%。2012年，塞提·[44]等人报告了127例肾淀粉样变性的鉴定结果，其中122例被成功分类，包括罕见的ALet2、AGel、AApoA-1和apoa-4。
……，但是没有关于两性离子3-16是否比其他类型的提取物有优势的报道。近年来，石蜡标本蛋白提取试剂盒的出现大大简化了操作过程，保证了更好的提取效率，因此备受青睐。
在本实验中，我们使用了五种目前使用的蛋白质提取物来分析来自大鼠不同器官的FFPE显微切割标本的蛋白质组成，以确定最佳的蛋白质提取物和实验过程，并将其应用于随后的淀粉样变性质谱分型。为了验证最佳溶胞产物是否也适用于大量组织的蛋白质提取，我们进一步比较了五种溶胞产物在大鼠FFPE普通切片中的提取效率。
………。
1实验材料
1.1组织标本
SD大鼠心脏、肝脏、肺、大脑和肾脏的FFPE标本(雄性，10周)
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4讨论
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结论
我们通过滤膜样品处理、微波辅助酶消化、蛋白质鉴定结果优化等方面改进了LMD/质谱鉴定淀粉样蛋白亚型的方法，准确诊断了133例患者中的121例，成功率为91.0%。与传统血清学试验和IHC相比，质谱分析具有明显优势。在各种类型的组织中，腹壁脂肪诊断的成功率相对较低，但由于腹壁脂肪活检具有操作简单、创伤小的优点，如何通过过程改进来提高诊断的准确性需要在今后进一步研究。
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参考资料(略)