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72110字博士毕业论文古龙酸一步发酵工程菌的建立和改进

论文类型:博士毕业论文
论文字数:72110字
论点:山梨,蛋白,发酵
论文概述:

本文是博士研究生论文, 有研究表明,将不影响菌体生长与代谢的膜结合蛋白进行敲除以后,可以为外源表达的膜结合蛋白提供更多的空间,从而提高目标产物浓度。

论文正文:

第一章引言

20世纪70年代初,中国科学家和技术人员发明了维生素C两步发酵法,获得国家发明二等奖,并很快在全国推广。这种方法大大简化了莱勒法的生产过程,降低了产品的生产成本,提高了[10]的转化率。因此,它得到了国内外维生素C制造商的大力推广。在此过程中,氧化葡萄糖将D-山梨糖醇转化为L-山梨糖,而L-山梨糖转化为2-KLG的过程是由普通生酮古洛糖酸盐和巨大芽孢杆菌组成的混合细菌发酵系统完成的。其中,k vulgare是产酸细菌,是典型的革兰氏阴性细菌。在发酵过程中,左旋山梨糖转化为2-KLG。k vulgare生长缓慢,单独培养时几乎不产酸。巨大芽孢杆菌是一种伴生细菌,是一种典型的革兰氏阳性细菌。它不直接参与L-山梨糖向2-KLG转化过程中相关酶的催化反应过程,但它能显著促进外阴钾的生长和2-KLG在混合细菌系统[5,9,11,12]中的积累。如果巨大芽孢杆菌从混合细菌系统中去除,产酸细菌外阴芽孢杆菌的生长率将显著降低,并且几乎不再具有合成2-KLG的能力。相反,在2-KLG发酵中,外阴角杆菌的存在也对巨大芽孢杆菌[的生长有显著的促进作用。我国的研究人员从未停止对两步发酵法的研究工作。在过去的20年里,他们在两种细菌的关系、培养基优化、细胞融合、生态调控等方面做了大量工作,进一步提高了两步发酵法的工艺稳定性和2-KLG [14-18的产量和产量。
……

第2章2-KLG合成关键基因的克隆和鉴定

2.1前言
k vulgare具有非常高的将左旋山梨糖转化为2-KLG的能力。事实证明,钾离子中不仅存在一种硫酸氢盐和硫酸氢盐,而且多种硫酸氢盐和硫酸氢盐的共同作用使钾离子具有很高的转化能力。不同菌株中琥珀酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶的辅酶不同。这些脱氢酶的鉴定对于构建一步发酵工程菌以高效生产2-KLG至关重要。本研究涉及的维生素C工业生产菌株WSH-001和巨大芽孢杆菌WSH-002均完成了全基因组测序,并在本实验室以前的研究中作了初步评论。本章首先对测序基因组进行更深入的开放阅读框架(ORF)预测和注释,并在NCBI、KEGG、BRENDA等数据库中搜索预测的ORF,寻找与已知功能蛋白序列具有较高同源性的ORF。根据基因组注释信息,找出所有与L-山梨糖合成2-KLG代谢途径相关的脱氢酶,并在大肠杆菌中表达,蛋白质纯化后,分析一系列脱氢酶的酶学性质,结合亲水/疏水分析和跨膜预测,确定它们在细胞中的功能和定位。这将为进一步发酵构建2-KLG重组菌株奠定基础。

2.2材料和方法
质粒小量提取试剂盒、基因组提取试剂盒、溶菌酶、异丙基-D-硫代半乳糖(IPTG)、氨苄西林、卡那霉素、Taq脱氧核糖核酸聚合酶均购自上海龚升生物工程有限公司;脱氧核糖核酸标记、限制性内切酶、连接酶溶液ⅰ、引物脱氧核糖核酸聚合酶、大肠杆菌能力制备试剂盒、脱氧核糖核酸凝胶回收试剂盒、脱氧核糖核酸柱回收试剂盒和琼脂糖均购自大连宝生物工程有限公司。吩嗪甲基硫酸盐(PMS)、2,6-二氯靛酚(2,6-DCIP)和PQQ购自上海西格玛-奥德里奇公司。SDS-PAGE试剂盒和蛋白质标准分子量购自Bi田芸生物技术研究所。蛋白胨和酵母粉购自OXIOD。LB培养基:10gl–1胰蛋白胨,5gl–1酵母粉,10g·L-1氯化钠,pH7.4。筛选大肠杆菌JM109转化体时,向培养基中加入100μGML–1氨苄青霉素或50μGML–1卡那霉素。结核培养基:12gl–1胰蛋白胨,24gl–1酵母粉,4毫升甘油,2.31克L-1 KH2PO4,12.54克L-1 K2HPO4,pH 7.0。当诱导重组细菌表达时,向培养基中加入50μGML-1卡那霉素。山梨醇培养基:20 G1–1山梨糖,3 G1–1酵母提取物,10 G1–1蛋白胨,3 G1–1牛肉膏,1.5 G1–1玉米浆,1 G1–1尿素,1 G1–1碳酸钙,0.2 G1–1硫酸镁,1 G1–1磷酸二氢钾,pH 6.7-7.0。

第三章大肠杆菌分子转化一步发酵生产2-KLG...................29
3.1前言..............................29
3.2材料方法................29
3.3结果和讨论...................30
氧化葡糖杆菌基因组测序及基因操作系统的构建..........................................37

4.1前言...................37
4.2材料和方法……37
第五章氧化葡糖杆菌工程菌的构建及肽工程与辅因子工程相结合的一步工程菌转化……47
5.1前言...................47
5.2材料和方法...................47

第6章基于耐热交联蛋白CutA
氧化葡糖杆菌一步工程菌的修饰

6.1前言
耐热交联蛋白CutA来源于堀江平焦球菌,最适生长温度为95-105℃。蛋白质的变性温度为150℃,以三聚体的形式存在,可用作蛋白质支架来提高蛋白质的稳定性[。本章对脱氢酶基因k0203和k0095的最佳组合进行密码子优化,然后将优化后的脱氢酶基因与CutA共表达,CutA作为蛋白质支架提高酶的稳定性和催化效率,最终获得2-KLG产量的增加。第五章,辅酶PQQ的过量表达有效提高了2-KLG的产量。在这一章中,PQQ也是在以CutA为蛋白支架构建的氧化葡萄糖一步工程菌的基础上表达的,通过增加辅酶的供应进一步提高了2-KLG的产量。

6.2材料方法
SH3和SH3lig被用作对接蛋白,以库塔·[138为基础构建一步工程菌。sh3和SH3 LiG-(gggggs)2-cuta首先被优化并组合成密集代码,然后优化的SH3和k0203-gggs-k0095被融合。SH3 lig-(GGG ggs)2-cuti与tufB启动子融合,得到的SH3-k 0203-GGS-k 0095和TuFb-SH3 lig-(GGG ggs)2-cuti通过酶切插入pGUC-tufB的KPni/BaMi和BaMi/XBaI位点。将获得的重表位集pguc-tufb-sh3-k 0203-gggs-k 0095-tufb-sh3 lig-(gggs)2-cuta电泳转移到氧化假单胞菌WSH-003中,获得一步工程菌,缩写为氧化单胞菌/pguc-tufb-k0203-gs-k0095-cuta。
……

主要结论和展望

主要结论
(1)根据WSH-001基因组的初步注释,进一步预测和注释ORF,最终获得与L-山梨糖合成2-KLG代谢途径相关的关键酶,包括KVU_1366、KVU_0203、KVU_2159、KVU_2142、KVU_PA0245、KVU_0095和KVU _ 0095为了验证7种预测关键酶的酶学性质,分别在大肠杆菌中表达和纯化。酶活性测定表明,7种脱氢酶是PQQ依赖性酶。KVU_1366、KVU_0203、KVU_2142、KVU_2159和KVU_PA0245同时具有SDH和SNDH活动。KVU_2142比酶活最高,为9.68 U/mg,是其他酶的3-10倍。然而,KVU_PB0115和KVU_0095仅具有SNDH活性,后者的活性几乎是前者的两倍,两者都远高于上述5个SDH/SNDH的SNDH活性。酶动力学参数的进一步测定表明,在5 SDH/SNDH和2 SNDH中,KVU_2142和KVU_0095理论上具有最高的底物结合能力,与酶活性测定结果基本一致。体外催化活性测定表明,将酶溶液与PQQ孵育5 min后,左旋山梨糖可转化为2-KLG。测定了5-硫酸氢钠/硫酸氢钠单独或与硫酸氢钠联合催化1-山梨糖生成2-KLG的能力。结果表明,5个硫酸氢钠/硫酸氢钠单独和与2个硫酸氢钠组合催化1-山梨糖生成2-KLG,其中由KVU_2142和KVU_0095组合生成的2-KLG的最高浓度为19.7 GL–1。

前景
(1)研究表明,剔除不影响细胞生长和代谢的膜结合蛋白后,可以为外源表达的膜结合蛋白提供更多空,从而增加目标产物的浓度。氧化弧菌WSH-003基因组信息表明,该细菌具有大量的膜结合蛋白。敲除一些不重要的膜结合蛋白可以增加脱氢酶/SNDH和SNDH的表达,从而增加2-KLG的产量。(2)本研究获得了最高产量为42.6 GL-1的2-KLG一步工程菌株,但在摇瓶相同的培养条件下和控制上罐发酵中较好的酸碱度下,2-KLG的产量没有提高。氧化葡萄糖是一种需氧细菌。充足的氧气供应可以保持细菌的呼吸活力并保持快速的生长速度。然而,当溶解氧浓度过高时,将产生羟基自由基,活性氧物种如超氧阴离子将破坏细胞成分并影响细胞代谢。同时,代谢转移很容易发生。细菌在不同阶段的耗氧量是不同的。因此,研究溶解氧控制对发酵的影响具有重要意义。通过控制不同阶段的溶解氧,可以有效提高2-KLG的产量。
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参考文献(省略)